卢雅敏,毛文杰
广东省韶关市粤北人民医院检验科,广东韶关 512026
腿伤凯斯特菌是一种2003年才被发现的新的革兰阴性杆菌[1]。在分类学上,该菌隶属于产碱杆菌科,其菌名源于比利时微生物学家凯斯特的名字。因该菌多分离自腿部伤口,故命名为腿伤凯斯特菌或肢体凯斯特菌。截至目前,在PubMed上以“Kerstersia gyiorum”为关键词检索与人类疾病相关的文献仅能检出15篇,在万方医学和中国知网上有关该菌与人类疾病相关的中文报道仅1篇[2],因此临床对该菌的认识和了解还极其有限。2021年11月至2022年2月,本院共从来自临床的呼吸道标本检出3例腿伤凯斯特菌,本研究对所有检出该菌的患者进行回顾性分析,现报道如下 。
1.1一般资料 患者1,男,56岁,2021年从高处摔下致颅脑外伤,行硬膜外血肿清除术+器官切开术,术后持续神志不清,插导尿管,持续卧床状态,有咳嗽、咳痰,2021年1月30日入住本院神经外科2区。患者2,男,63岁,于2007年车祸致颅脑损伤,开颅术后持续昏迷不醒,植物人状态,2021年1月13日入住本院神经外科2区。患者3,男,78岁,2020年11月因脑出血行开颅手术,术后间断神志障碍及四肢运动减退,于入院前5 d因出现氧饱和度低,抽搐,2022年1月20日入住本院重症监护病房(ICU)。
1.2方法
1.2.1痰培养 将痰液标本分别接种于血平板、麦康凯平板和沙保罗平板(郑州安图生物公司产品),血平板和麦康凯平板置于35 ℃含有5%CO2孵育箱过夜,沙保罗平板置于28 ℃孵育箱过夜,24 h后观察菌落生长情况。
1.2.2菌种鉴定及药敏试验 采用革兰染色法进行细菌形态学观察,分别应用德国布鲁克公司基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)和法国梅里埃公司VITEK2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行细菌鉴定和药敏试验,应用布鲁克质谱仪配套软件(MALDI Flex Control Analysis 和 MALDI Biotyper 3.0)进行蛋白质指纹图采集和分析鉴定。标本制备、检测和结果分析参照MALDI-TOF-MS和VITEK2 Compact鉴定操作流程和标准化操作专家共识。
1.2.3同源性分析 应用布鲁克质谱仪配套软件Bruker MALDI-Biotyper3.0根据菌株的蛋白指纹图谱进行核心图谱(MSP)聚类分析并构建发育树。
2.13例患者的基本资料及实验室检查指标 3例患者留取痰液标本当天的基本资料和相关炎症指标见表1、2。3例患者白细胞计数分别为正常(患者1)、略高(患者2)和降低(患者3),粒细胞百分比仅患者2和患者3升高,3例患者的降钙素原水平均有升高,C反应蛋白在进行过该项检测的患者2和患者3中均显示增高。
表1 3例患者的基本资料
表2 3例检出腿伤凯斯特菌的患者留取标本当天实验室检查指标
2.2微生物学检查 孵育箱培养24 h后,血平板上出现扁平、浅灰色、呈磨砂质感的边缘扩散状菌落形态,麦康凯平板上的菌落也呈扩散状,菌落中间部分产薰衣草样色素。将纯的菌落革兰染色后观察,镜下为革兰阴性杆菌。手工生化反应显示:氧化酶实验阴性,过氧化氢酶强阳性。挑取纯菌落用MALDI-TOF MS进行菌种鉴定,多次鉴定结果为腿伤凯斯特菌,且评分均为2.2~2.4分,鉴定结果可靠。进一步采用16S rRNA进行测序验证,所测基因序列与Genbank数据库中的序列进行同源性分析,鉴定为腿伤凯斯特菌。采用Vitek2 compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行药敏试验,根据美国临床实验室标准协会其他非肠杆菌目细菌最小抑菌浓度(MIC)折点判断标准,3株菌株药敏结果见表3。
表3 3株腿伤凯斯特菌药敏试验结果
续表3 3株腿伤凯斯特菌药敏试验结果
2.3同源性分析 通过质谱仪的分析软件Flexanalysis获得了菌株的蛋白质指纹峰信息,见图1。再将蛋白质指纹峰谱图导人MALDI-Biotyper 3 软件进行聚类分析。从聚类分析图中可发现:3株菌可分为2个大类,例1和例2亲缘关系非常接近,例3与例1和例2亲缘关系较远,见图2。
图1 K1菌株蛋白指纹图谱
图2 3例患者核心图谱聚类分析树形图
从2003年腿伤凯斯特菌被首次报道至2022年,在PubMed上能检索到的关于该菌与人类疾病相关的英文报道共15篇,涉及19个病例。包括了与下肢伤口感染相关的6例[3-6],跟耳道感染相关的9例[3,7-10],血流感染相关的1例[4],其余有呼吸道感染2例[11-12],尿路感染1例[13]。根据培养结果调整抗菌药物使用后,多数患者症状缓解或治愈,部分患者在分离出该菌的同时也分离出其他不同种类的菌株,因此并不能完全确认该菌在患处的致病意义。国内发现并报道的仅四川省2例[2,12]。本研究3例患者留取痰液标本当天患者1和患者3均无发热表现,仅呼吸道有痰液,肺部X线片提示有少许炎症,患者1的痰液标本在分离出腿伤凯斯特菌的同时也分离出铜绿假单胞菌,患者2的痰液标本同时检出鲍曼不动杆菌。与先前多篇报道相似,腿伤凯斯特菌与其他细菌有伴随生长的情况[3,11],因没有足够的证据支持腿伤凯斯特菌为病原菌,后续临床没有针对该菌采取相应的抗感染治疗方案。由此推测腿伤凯斯特菌在这3例患者身上,可能是上呼吸道的定植菌。笔者认为如果需要确定该菌是否是病原菌,则需要临床医生和实验室加强交流合作,查找出更多感染相关的证据,同时,需对其毒力因子和致病机制进行更深入的研究。
2015年美国的BOSTWLCK等[4]报道了1例腿伤凯斯特菌引起的败血症,这引起了人们对该菌更多的关注。2019年研究者对来自中国的1例呼吸道分离的菌株进行了全基因组测序[12],发现该菌携带有耐药基因和多种药物外排泵,巴西的1例慢性伤口感染的病例显示他们分离的1株腿伤凯斯特菌为环丙沙星耐药株[14],笔者认为外排泵可能是该菌株对环丙沙星耐药的主要机制。本报道患者1和患者2检出腿伤凯斯特菌的时间为2021年11月,均住在本院神经内科2区,尽管已经咨询过临床科室这2例患者的诊疗过程是否有共同医护人员或诊疗器械物品,均被否认,但是因为二者住院时间存在交集,因此也不能完全排除腿伤凯斯特菌在这2例患者之间有传播的可能。患者2于2021年12月5日后续治疗转移ICU二区病房,患者3是在ICU一区住院期间痰液中分离出的腿伤凯斯特菌,对检出的3株菌进行聚类分析时,患者1 和患者2显示有高度同源性,而与患者3亲缘关系较远,推断患者2的菌株来源于同病区的患者1。因此该菌的存在应引起临床和医院感染部门重视,防止耐药基因以腿伤凯斯特菌为载体在院内进行传播。综合本报道的3例患者和之前报道的呼吸道分离出腿伤凯斯特菌的报道,这些患者均有气管切开或长期机械通气的情况,因此无论腿伤凯斯特菌是否属于上呼吸道定植菌,都有导致下呼吸道感染的风险。本研究3例患者均为开颅术后长期卧床且昏迷的状态,既往也有报道称腿伤凯斯特菌多发生于患有慢性炎症、免疫力低下的患者[6,11],这与本报道的3例患者情况是符合的。
腿伤凯斯特菌的鉴定自首次发现以来,主要通过MALDI-TOF-MS进行鉴定或通过测序16S rRNA进行识别。前期有研究通过VITEK2 Compact仪器法进行鉴定时,得出鉴定为不动杆菌属的概率为34%,为荧光假单胞菌的概率为33%[8]。一方面因为目前多数商业性菌种库还未包含腿伤凯斯特菌,另外一方面腿伤凯斯特菌生化特征与粪产碱杆菌相似,利用生化反应检测原理进行菌种鉴定时极易混淆。但腿伤凯斯特菌氧化酶阴性、脲酶阴性、过氧化氢酶强阳性且具有特殊的气味,结合其扁平、边缘呈扩散状的菌落形态,临床微生物室在见到上述特征的菌株时要考虑为腿伤凯斯特菌的可能。当前该菌检出和报道不多见,一方面可能源于传统鉴定方法功能的有限性,另外一方面可能源于实验室对该菌的认知不足,在呼吸道标本中检出时往往被其他菌群掩盖或作为正常菌群处理。随着MALDI-TOF MS和16S rRNA测序技术的普及,在当今分子诊断时代,未来可能会有更多新的少见细菌被发现,而它们与人类疾病的关系也需要被一一定义。
综上所述,尽管腿伤凯斯特菌当前仍属罕见,作为一种对当前多数抗菌药物都敏感但携带耐药基因的新的菌种,临床微生物室很容易将标本中分离出的腿伤凯斯特菌判定为污染,对于长期卧床需要机械通气的患者应予以关注,积极改善患者基础疾病,提高免疫功能,防止这类罕见菌种对免疫力低下患者造成感染,引起严重后果。同时,该菌在院内进行传播所带来的危害性不容小觑,临床应合理使用抗菌药物,强化医护人员、陪护人员手卫生,切实做好医院内感染控制工作。