佛山市中医院耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌的产酶型别及耐药性分析*

吴 英，雷 蕾，刘礼初，张小玲，钟幸容

广东省佛山市中医院检验医学科，广东佛山 528000

肠杆菌目细菌是临床上的主要病原菌之一，以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌最常见。碳青霉烯类药物是治疗肠杆菌目细菌感染的首选药物。然而近年来，常有不合理使用碳青霉烯类药物的现象，导致耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(CRE)迅速流行，而且CRE的耐药性也在逐年递增。美国疾病预防控制中心(CDC)关于CRE的定义[1]为满足以下任意一个条件:(1)对亚胺培南、美罗培南(MEM)、厄他培南或多利培南任何一种碳青霉烯类药物耐药;(2)对于天然对亚胺培南敏感性降低的细菌(如摩根菌属、变形杆菌属和普罗威登菌属等)，需参考除亚胺培南外的其他碳青霉烯类抗菌药物的药敏结果；(3)产生碳青霉烯酶。

针对细菌耐药的显著问题，美国CDC把18种重要耐药菌分为3个级别：紧急威胁、严重威胁和值得关注级别，并在2013年首次将CRE列为对全球公众健康构成紧急威胁的级别[2]。而到了2019年，CRE仍然被列为紧急威胁的行列。一旦发生CRE感染，病死率高达70%[3]，临床迫切需要新的抗菌药物。头孢他啶/阿维巴坦(CZA)由第三代头孢菌素头孢他啶和β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦组成。阿维巴坦的独特作用机制是通过共价(缓慢可逆)结合和失活β-内酰胺酶来阻止头孢他啶的水解，具有长效的抑酶作用。本研究旨在研究本院CRE的碳青霉烯酶类别、对CZA等抗菌药物的耐药性，CZA与MEM、氨曲南(ATM)的联合作用。

1 资料与方法

1.1菌株来源 收集佛山市中医院2020年1月1日至2022年3月1日住院患者临床标本分离的CRE 95株(剔除同一患者同一部位的重复菌株)，其中分泌物标本46株，尿液标本25株，痰液标本15株，肺泡灌洗液标本4株，腹部引流液、血液、脓液、胆汁、脑脊液各1株。

1.2仪器与试剂 VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪和VITEK MS质谱仪均购自法国生物梅里埃公司；药敏卡(AST-N334卡)为配套试剂；MH培养基购于郑州安图绿科生物工程有限公司；血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤购于江门凯林贸易有限公司；药物敏感试验(简称药敏试验)纸片MEM 10 μg、CZA 50 μg、ATM 30 μg均购自英国Oxoid公司。碳青霉烯酶检测试剂盒购自北京金山川科技发展有限公司。鉴定和药敏质控菌株有大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)；肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-1705 (KPC型碳青霉烯酶阳性株)、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146 (NDM型金属β-内酰胺酶阳性株)均购自中国菌种保藏中心。

1.3方法

1.3.1细菌培养及鉴定 临床标本采集和细菌分离培养严格按照《全国临床检验操作规程》[4]进行。菌株由法国梅里埃VITEK MS质谱仪鉴定。

1.3.2生物药敏试验 采用AST-N334卡在VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪上进行药敏试验，用纸片扩散(K-B)法进行补充。结果判断标准采用2020年美国临床实验室标准化协会(CLSI)M100最新版本[5]。CZA药敏试验采用K-B法，判断标准是抑菌圈直径≥21 mm为敏感，≤20 mm为耐药。CZA与ATM、MEM的联合药敏试验参照K-B法联合药敏试验[6]，两药敏纸片之间相隔20～30 mm。结果判断：根据呈现的抑菌图形报告协同或无关。改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)和乙二胺四乙酸(EDTA)改良碳青霉烯灭活试验(eCIM)方法及结果判断均参照2020年CLSI M100[5]标准进行。

1.3.3胶体金免疫层析法检测碳青霉烯酶耐药基因型 快速检测KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48、OXA-23这6种碳青霉烯酶基因型。按照试剂盒操作：向无菌EP管中滴入10滴标本处理液，用一次性接种环蘸取过夜培养的纯菌落，插入滴有标本处理液的无菌EP管中，充分搅拌使其与溶液混匀，取50 μL处理后的标本加至胶体金检测盒的加样孔，10 min后读取结果。在检测卡的检测区域中出现2条红色条带(检测条带和对照条带)，即结果为阳性；仅出现1个对照条带表明检测结果为阴性；如对照条带未出，说明该检测无效，需重测。质量控制：试剂盒阳性质控需检测结果为阳性。

1.4统计学处理 采用Whonet 5.6 软件进行菌株数量分布和耐药性统计。采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CRE细菌种类分布 95株CRE菌株中，排名前3位的分别是肺炎克雷伯菌(39株，41.0%)、大肠埃希菌(27株，28.4%)、阴沟肠杆菌复合群(18株，18.9%)。见表1。

表1 CRE细菌种类及构成比

续表1 CRE细菌种类及构成比

2.2CRE主要细菌对常用抗菌药物的耐药率比较 95株CRE菌株对头孢曲松、头孢呋辛、阿莫西林/克拉维酸的耐药率≥90.5%，对阿米卡星的耐药率≤26.3%，对替加环素的耐药率≤1.1%。阴沟肠杆菌复合群对亚胺培南、MEM、复方磺胺甲噁唑的耐药率均低于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌，对阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率低于肺炎克雷伯菌(P<0.05)。见表2。

表2 95株CRE菌株对常用抗菌药物的耐药率比较[n(%)]

2.3mCIM、eCIM 检测结果及碳青霉烯酶耐药基因型结果 95株CRE中，mCIM试验阳性菌株93株(97.9%)，不产酶2株(2.1%)，而eCIM试验阳性菌株49株(51.6%)。检测93株产酶CRE菌株携带的碳青霉烯酶耐药基因，44株丝氨酸酶菌株中检出43株携带KPC耐药基因，1株携带非KPC耐药基因；49株产金属β-内酰胺酶菌株全部检出携带NDM耐药基因；未检出携带VIM、IMP、OXA-48、OXA-23耐药基因的菌株。见表3。

表3 mCIM、eCIM的检测结果和碳青霉烯耐药基因分布

续表3 mCIM、eCIM的检测结果和碳青霉烯耐药基因分布

2.4CZA的K-B药敏结果及CAZ与MEM、ATM联合药敏试验结果 44株产丝氨酸酶菌株对CZA敏感率为97.7%，49株金属β-内酰胺酶菌株对CZA敏感率为0.0%，2株不产酶菌株对CZA敏感率为100.0%。对主要CRE菌株CR-KP和CR-ECO进行CAZ与MEM、ATM的联合药敏试验。见表4。

表4 CAZ与MEM、ATM联合药敏试验结果(n)

3 讨 论

CRE感染多发生于有严重基础疾病、免疫缺陷和(或)长期反复使用广谱抗菌药物的患者，预后差，尤其是CRE血流感染患者[7]。 2021年中国细菌耐药监测数据显示，全国碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的检出率平均值已高达10.9%，肺炎克雷伯菌对亚胺培南和MEM的耐药率已分别上升至26.4%和28.0%。随着抗菌药物的发展和使用，肠杆菌目细菌的耐药性越来越强，而CRE引起的感染性疾病也威胁着公众的健康。

本研究中，CRE菌株检出排名前3位的是肺炎克雷伯菌(39株，41.1%)、大肠埃希菌(27株，28.4%)、阴沟肠杆菌复合群(18株，18.9%)。95株CRE菌株对头孢曲松、头孢呋辛、阿莫西林/克拉维酸的耐药率≥90.5%，对阿米卡星的耐药率≤26.3% ，对替加环素的耐药率≤1.1%。阴沟肠杆菌复合群对亚胺培南、MEM、复方磺胺甲噁唑耐药率均低于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌，对阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率低于肺炎克雷伯菌(P<0.05)。由此可见，CRE对大多数抗菌药物耐药性较高，加大了临床的治疗难度。

CRE的主要耐药机制是产碳青霉烯酶，因其编码基因大都位于可转移元件如质粒或转座子上，可在不同菌种菌属间互相传播。CLSI推荐mCIM试验检出产碳青霉烯酶菌株，eCIM试验在mCIM结果阳性的前提下，结果阳性提示产金属β-内酰胺酶，阴性提示产丝氨酸碳青霉烯酶(不能排除产金属β-内酰胺酶，存在2种酶并存的可能)。由表3可知，95株CRE中，mCIM试验阳性菌株93株(97.9%)，不产酶2株(2.1%)，而eCIM试验阳性菌株49株(51.6%)，因此产丝氨酸酶44株(46.3%)，产金属β-内酰胺酶49株(51.6%)。胶体金免疫层析法检测93株产酶CRE菌株携带的碳青霉烯酶耐药基因，44株丝氨酸酶菌株中检出43株携带KPC耐药基因，1株携带非KPC耐药基因(试剂盒丝氨酸酶基因型仅有KPC)；49株产金属β-内酰胺酶菌株全部检出携带NDM耐药基因；未检出携带VIM、IMP、OXA-48、OXA-23耐药基因的菌株。肺炎克雷伯菌CRE主要携带KPC型，占89.7%(35/39)，而大肠埃希菌CRE主要携带NDM型，占88.5%(23/26)，阴沟肠杆菌复合群也是携带NDM型为主，占88.2%(15/17)，构成比与王群等[8]报道类似，与高春海等[9]报道不同，可见不同医院流行的CRE菌株构成比或占比均有差异。胶体金免疫层析法结果与mCIM、eCIM的检测结果几乎一致，且操作简单，容易判读，可以作为快速检测碳青霉烯酶的一种新方法。

阿维巴坦是三乙烯二胺类酶抑制剂，能够抑制包括碳青霉烯酶在内的A类、C类β-内酰胺酶，同时还对某些D类酶(OXA-10，OXA-48)具有抑制作用，但是对B类金属β-内酰胺酶无效。CIA对于包括产KPC 酶在内的多重耐药革兰阴性杆菌均具有良好的抗菌活性，敏感率超过90%，是第一个可用于产KPC酶肠杆菌科细菌感染治疗的新型β-内酰胺抗生素/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂。本研究中，44株产丝氨酸酶菌株对CZA敏感率为97.7%，可见产丝氨酸酶菌株对CZA有较高敏感性；而49株产金属β-内酰胺酶菌株对CZA全部耐药，由此可见，检测碳青霉烯酶型别显得尤为重要。

因CRE菌对大多数药物多重耐药，临床可使用的药物有限，此次对主要CRE菌CZA和MEM、ATM进行联合药敏试验，结果发现： 35株携带KPC基因的肺炎克雷伯菌有33株CZA和MEM、CZA和ATM有协同作用，未发现无关和拮抗作用，说明KPC基因型的肺炎克雷伯菌CZA联合MEM、ATM产生了较好的体外抗菌活性；23株携带NDM基因大肠埃希菌中，有19株CZA和ATM有协同作用，说明对于携带NDM基因型的大肠埃希菌CZA联合ATM产生了较好的体外抗菌活性。

综上所述，佛山市中医院CRE以肺炎克雷伯菌检出率最高，主要以携带KPC基因型为主，其次是大肠埃希菌，以携带NDM基因型为主。CRE菌株对常用的多种抗菌药物呈多重耐药性，能使用的药物十分有限。在极少抗菌药物能应用时，可以通过检测CZA和MEM、CZA和ATM是否协同作用来制订抗感染策略。面对CRE目前世界性的流行和传播，应根据当地CRE流行特点，对CRE进行早期基因型别检测，尽可能控制CRE的感染和流行。同时，下一步准备深入研究CRE的耐药机制，对于指导临床合理用药治疗及研发新型抗菌药物具有深远意义。