不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰生长性能、体色及肠道健康的影响

刘 祥，易新文，胡 毅，钟 蕾*

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南省特色水产资源利用工程技术研究中心，湖南长沙 410128；2．深圳市澳华集团股份有限公司，广东深圳 518067）

全球贸易形势变化和世界范围饲料原料资源短缺导致鱼粉、豆粕等常规蛋白源的供用不稳定、价格上涨等问题，因此，寻找新型非粮蛋白源迫在眉睫。近年来，我国玉米深加工产业迅猛发展，2019年我国玉米消费量约2.78亿t，其中约8300万t用于玉米深加工工业（刘玉春等，2017）。玉米深加工过程中的副产物如玉米DDGS、玉米皮、玉米蛋白粉、玉米胚芽粕等蛋白含量高，均有作为蛋白源应用到水产饲料中的潜力。喷浆玉米皮是将玉米浸泡、破碎后分离出的玉米表皮与其浓缩得到的玉米浆混合干燥后加工而成的一种副产物（Ramirez等，2008），其营养成分主要是膳食纤维、蛋白质、脂类、淀粉及其他微量成分，其中蛋白含量为17%～25%（王红玉等，2016；王遂等，2000）。有研究表明，喷浆玉米皮可用于波杂羔羊与山羊养殖中，增重效果良好（尹福泉等，2018；钱勇等，2007）。Jeremiah等（2007）研究表明，饲料中补充玉米皮能显著提高罗非鱼（Oreochromis mossambicus）的增重率；Galeana-López等（2020）发现，饲料中补充玉米皮粉对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）生长性能无显著影响。舒维成（2017）发现，用喷浆玉米皮饲喂樱桃谷鸭可促进肠道发育，增加胸肌的黄度值。由此可见玉米加工副产物在动物饲料中具有应用潜力。

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）是我国重要的淡水经济养殖品种，2019年鮰鱼总产量约为30万t（于秀娟等，2020）。饲料中蛋白质含量对斑点叉尾鮰幼鱼生长起决定性作用。有研究表明斑点叉尾鮰蛋白需求为32%～35%（冯端林等，2014；王广军等，2005），而蛋白含量过高或过低都会导致生长减慢和饲料效率降低，因此进一步精准斑点叉尾鮰蛋白质需求对促进鮰鱼生长，降低养殖成本有重要意义。另外，斑点叉尾鮰体色和肉色与其市场价值密切相关，皮肤和肌肉偏黄均会降低斑点叉尾鮰经济价值。饲料中的一些色素如类胡萝卜素、玉米黄素、虾青素等是影响斑点叉尾鮰体色和肉色变化的主要因素（万祖德等，2016；叶元土，2009）。喷浆玉米皮中含有玉米黄色素，而该色素会导致斑点叉尾鮰体色变黄（刘军海，2008）。因此，本试验主要探究不同蛋白水平和喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰生长、体色、肉色及肠道健康的影响，精确斑点叉尾鮰蛋白需求量及在不影响斑点叉尾鮰体色的前提下喷浆玉米皮可添加量，为喷浆玉米皮在水产饲料中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料 以豆粕、鱼粉为蛋白源，豆油为主要脂肪源制成基础配方，在其基础上分别添加0、30、60、90 g/kg制成喷浆玉米皮含量分别为0（对照）、3%、6%、9%的四种试验饲料，饲料蛋白含量依次为34%、35%、33%、32%。饲料原料经粉碎机后过60目筛，准确称量后逐级混合均匀，然后分别加入油脂与水混匀，制粒压成2 mm粒径的颗粒饵料，风干保存。

1.2 饲养与管理 试验在湖南娄底车田江水库网箱中进行，斑点叉尾鮰幼鱼购自涟源市水产养殖场。试验前期，挑选规格一致的斑点叉尾鮰，通过网箱（5.0 m×4.0 m×3.0 m）暂养驯化，用对照组饲料驯化2周，饥饿24 h后，挑选体格健壮、大小均匀的斑点叉尾鮰[（50±0.02）g]随机分配于20个网箱中（1.5 m×1.5 m×1.5 m聚乙烯网箱），每个网箱放养50尾。本试验共设4组，每组5个重复。每天投喂3次，投喂时间分别为6：00，12：00和19：00，采用饱食投喂并根据斑点叉尾鮰摄食情况加以调整，记录饲料投喂量。整个养殖期间，水温为（26.0±1.2）℃，溶解氧5 mg/L左右，总氨氮小于0.01 mg/L，pH为7.4～7.8，养殖周期为8周。

表1 饲料组成及营养水平（干物质）%

1.3 营养成分含量 粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定（GB/T5009.5-1985）；粗脂肪含量采用索氏抽提法测定（GB/T5009.6-1985）；粗灰分含量采用550℃高温灼烧法测定（GB/T5009.4-1985）。

1.4 生长性能指标 试验结束，禁食24 h后进行采样。记录每个网箱斑点叉尾鮰总重、总尾数，用于计算成活率（SR）、增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和饲料系数（FCR）。计算方法如下：

成活率/%=Nt/N0×100；

增重率/%=（Wt-W0）/W0×100；

饲料系数=W/（Wt-W0）；

特定生长率/（d/%）=（lnWt-lnW0）/T×100%；

式中：N0为初始尾数；Nt为终末尾数；W0为终末体重，g；Wt为初始体重，g；F为饲料投喂总量，g；T为养殖天数，d。

养殖试验结束后，每网箱随机取5尾斑点叉尾鮰记录体长和体重，然后解剖，分离内脏、肝脏和腹部脂肪，计算肝体比（HSI）、脏体比（VSI）、肥满度（CF）和腹脂率（AFP）。

肝体比/%=W1/Wh×100；

脏体比/%=Wv/Wh×100；

肥满度=Wh/L3×100；

腹脂率/%=Wf（g）/Wh（g）×100。

式中：W1为肝脏重；Wh为体重；Wv为内脏重，g；L为体长，cm；Wf为内脏重，g。

1.5 体色和肉色测定 养殖试验结束后，从每个网箱中随机取6尾鱼，参考梁高杨等（2019）的试验方法，用色差仪（NR110）测定腹部与侧线附近皮肤及背部肌肉的L*、a*、b*值。具体测样点如图1所示。

图1 皮肤和肌肉色度值测量点

1.6 肠道切片的制备与观察 养殖试验结束后，饥饿24 h，每箱随机取3尾斑点叉尾鮰，解剖，并取体积约为 （0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）的后肠组织，置于4%甲醛溶液中固定24 h，制样时取出，微流水冲洗，分别经浓度为30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇梯度脱水并置于二甲苯中透明，最后包埋于低熔点石蜡中，然后使用RM-2235型切片机横向切片，切片厚度5μm，然后HE方法染色，中性树胶封片。

1.7 肠道菌群分析 养殖试验结束后，从每组网箱中随机取9尾鱼，采集肠道内容物，保存于-80℃冰箱。依据生长指标，选取对照组、CG3组、CG9组进行后续肠道菌群分析。使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA试剂盒提取肠道内容物中的DNA，扩增16SrRNA基因V3～V4区域后利用Illumina MiSeq平台进行高通量测序（USA）。将原始序列根据条码分选到不同样品中，然后使用UCHIME过滤嵌合体序列。用“pick_open_reference_otus.py”命令将相似性大于99%的序列归为同一个分类操作单元（OTU）。利用香农指数（Shannon）、辛普森指数（Simpson）和物种丰富度指数（chao1）公式计算细菌生态多样性指数；使用Mothur软件制作柱状图、Venn图以作OTU分析。

1.8 数据统计分析 本实验所有的数据通过SPSS Statistics23 （IBM，Armonk，NY，USA）软件采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）并进行Duncan氏多重比较，P＜0.05表示差异显著，结果数据用“平均值±标准误”表示。

2 结果

2.1 不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰生长性能的影响 由表2可知，各组间斑点叉尾鮰末均重、增重率、存活率、饲料系数、肝体比、脏体比及肥满度无显著差异（P＞0.05），与对照组相比，试验组斑点叉尾鮰腹脂率显著降低（P＜0.05）。

表2 饲料中不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰生长性能的影响

2.2 不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰皮肤及肌肉色度值的影响 由表3可知，与对照组相比，CG3、CG6、CG9组斑点叉尾鮰肌肉黄度值（b*）显著提高；CG9组斑点叉尾鮰红度值（a*）显著高于CG3组；各试验组间斑点叉尾鮰侧面皮肤、腹部皮肤、肌肉颜色色度值（L*）均无显著差异。

表3 不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰皮肤及肌肉色度值的影响

2.3 不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰肠组织结构的影响 由表4可知，与对照组相比，CG3、CG6、CG9组斑点叉尾鮰肠道绒毛高度与杯状细胞数无显著差异（P＞0.05），对照组、C3组肠道肌层厚度显著高于CG6、CG9组（P＜0.05）。

表4 不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰肠道结构的影响

2.4 不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰肠道菌群的影响

2.4.1 肠道菌群多样性分析 由图2可知，对照组操作分类单元（OTU）数目为406个，CG3组OTU数目为301个，CG9组OTU数目为360个，3组共有的OTU数目为166个，对照组、CG3组、CG9组特有OTU数目分别为101、69、75个。

图2 OTU韦恩图

主坐标分析中，如果样品坐标距离越接近，表示物种组成结构越相似，因此群落结构相似度高的样品倾向于聚集在一起，群落结构差异大的样品则会远远分开。由图3可知，摄食相同饲料配方的斑点叉尾鮰肠道菌群样品倾向于聚集在一起，C3组样本与对照组距离较大，说明群落结构组成与对照组差异较大。

图3 基于OTU水平unweighted UniFrac距离的细菌属丰度的主成分分析

由图4可知，各组间斑点叉尾鮰肠道菌群的Chao1指数、ACE指数和Shannon指数无显著性差异（P＞0.05）。与对照组相比，CG3、CG9组斑点叉尾鮰Shannon指数有上升趋势，但差异不显著（P＞0.05），CG9组Simpson指数显著高于对照组和与CG3组（P＜0.05）。

图4 不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰肠道菌群α-多样性的影响

2.4.2 肠道菌群优势物种组成 通过对斑点叉尾鮰肠道菌群中门水平物种相对丰度进行统计分析发现（图5），其肠道优势菌门为梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、螺旋体门（Spirochaetes）等。由表5可知，与对照组、CG3组相比，CG9组梭杆菌门、厚壁菌门的相对丰度显著下降（P＜0.05），变形菌门相对丰度显著上升（P＜0.05）。

表5 门水平排名前三的物种相对丰度

图5 门水平物种相对丰度

由图6可知，斑点叉尾鮰肠道菌群中相对丰度最高的10个属为鲸杆菌属（cetobacterium）、邻单胞菌属（Plesiomonas）、乳球菌属（Lactococcus）、拟杆菌属 （Macellibacteroides）、罗姆布茨菌属（Romboutsia）、拟杆菌属（Bacteroides）、梭菌目未鉴定属（unidentified_Clostridiales）、假纤细芽孢杆菌属（Pseudogracilibacillus）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）和咸海鲜球（jeotgalicoccus）。由表6可知，与对照组、CG3组相比，CG9组鲸杆菌属与乳酸菌属相对丰度显著下降（P＜0.05）；CG9组邻单胞菌属的相对丰度显著上升（P＜0.05）。

表6 门水平排名前三的物种相对丰度

图6 属水平物种相对丰度

3 讨论

3.1 饲料中不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰生长和形体指标的影响 本研究发现不同水平喷浆玉米皮的添加对斑点叉尾鮰的增重率无显著性影响，这与Galeana-López（2020）、Jeremiah（2007）等研究结果一致。但李珊珊研究（2018）表明，喷浆玉米皮添加水平增加至15%，肉鸭生长性能显著降低。舒维成（2017）发现，饲料中用0、5%、10%、15%、20%的喷浆玉米皮会降低肉鸭的生产性能，这与本试验结果不一致。其原因可能是在喷浆玉米皮的加工过程中，会使用一定浓度的亚硫酸进行浸泡，因此会降低饲料适口性，影响其摄食。此外，随着喷浆玉米皮比例的增加，斑点叉尾鮰腹脂率显著降低，其原因可能是饲料中喷浆玉米皮中阿拉伯聚糖与胆固醇、脂肪吸附结合，降低了斑点叉尾鮰脂类物质的吸收（Vahouny等，1981）。

3.2 饲料中不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰体色和肉色的影响 斑点叉尾鮰自身不能合成色素，其体色的形成易受到环境和营养物质的影响。有研究表明叶黄素与玉米黄素两种黄色素会沉积在斑点叉尾鮰肌肉中，使斑点叉尾鮰体色偏黄（Li等，1981）。色素对斑点叉尾鮰皮肤着色效果的强度顺序依次为：叶黄素、玉米黄素、虾青素、角黄素、β-胡萝卜素（Robinson，1981）；冷向军等（2003）研究表明，饲料中添加叶黄素类产品对人工养殖的胡子鲶的体色有很好的改善作用；耿彬等（2021）发现，随着饲料中玉米DDGS添加水平的升高，斑点叉尾鮰肌肉黄度值（b*）值显著提高。本试验结果显示，添加不同水平喷浆玉米皮均可显著提高肌肉黄度值（b*）值，这与上述结果类似，其可能的原因是喷浆玉米皮作为一种内源性色素源，其含有丰富的玉米黄素，玉米黄素是一种油溶性天然色素，主要由叶黄素和隐黄素等类胡萝卜素所组成，其能较好的在斑点叉尾鮰体内沉积，导致体色变黄。因此饲料中添加一定程度喷浆玉米皮会显著影响斑点叉尾鮰体色，降低经济价值。

3.3 不同蛋白及喷浆玉米皮水平对斑点叉尾鮰肠道健康的影响 肠道结构的完整性是营养成分消化吸收和个体正常发育的生理学基础，是肠道屏障功能及黏膜免疫反应的必要条件（Dimitroglou等，2010）。本试验中，各组肠道绒毛高度、杯状细胞数均无显著性差异，但CG6、CG9组中肠绒毛部分出现脱落或破损、肌层皱缩变薄的现象。这与何娇娇等（2018）用玉米蛋白粉替代鱼粉蛋白60%时，大黄鱼（Larimichthys crocea）的肠道上皮细胞排列紊乱研究结果类似；吴莉芳等（2010）用去皮豆粕替代鱼粉蛋白60%时，埃及胡子鲇（Clarias lazera）的后肠肠道组织结构完整性被破坏。朱波等（2020）研究表明，当金针菇菌渣添加水平高于5%时，中肠绒毛高度下降，杯状细胞数量减少。这些研究与本试验结果一致，原因可能是喷浆玉米皮中含有一些抗营养因子如阿拉伯聚糖，可诱导炎症从而影响到肠道结构完整性并最终影响肠道功能。

肠道菌群是评价动物肠道健康的重要指标。稳定的菌群结构能够帮助营养物质的消化吸收、促进肠上皮细胞生长发育抵抗外来病原菌的入侵（温若竹，2010）。香浓指数（Shannon index）和辛普森指数（Simpson index）反映了肠道菌群多样性，香农指数和辛普森指数越大，说明群落多样性越高，物种分布越均匀。研究结果表明CG9组辛普森指数显著高于对照组与CG3组，这说明添加90 g/kg喷浆玉米皮显著提高了肠道菌群的多样性（P＜0.05）。这与吴韬研究结果（2015）一致，可能是植物蛋白中非淀粉多糖为肠道中微生物繁殖提供底物（徐秀容，2000），从而提高斑点叉尾鮰肠道菌群多样性。

本试验结果中斑点叉尾鮰肠道菌群中优势菌群门水平为梭杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门。这与耿彬等（2021）、何娇娇等（2018）研究结果（2018）相似。然而，当饲料中喷浆玉米皮添加比例达到9%时，斑点叉尾鮰肠道的梭杆菌门和厚壁菌门相对丰度低于对照组，变形菌门相对丰度高于对照组，结合肠道菌群多样性分析的数据，说明高剂量喷浆玉米皮替代改变了斑点叉尾鮰肠道菌群结构。这一变化趋势与王亚如等（2017）的研究结果类似，饲料中添加高水平豆粕显著改变了花鲈（Lateolabrax japonicas）肠道菌群门水平细菌的组成。此外，在喷浆玉米皮替代比例达到9%时，斑点叉尾鮰肠道中乳球菌属相对丰度显著低于对照组。乳球菌属为常见的益生菌属，此属中多个菌种在饲料中添加可促进肠道绒毛发育，提高肠道消化酶活性，增加肠道菌群多样性（Zhang等，2017；Shin等，2016；Merrifield，2010）。而本实验中邻单胞菌属相对丰度高于对照组，邻单胞菌属中一些菌种与肠道疾病有关，如类志贺邻单胞菌感染会使草鱼肠道出现乌黑色内容物，肝脾肿大（胡钱东等，2014）；感染大鲵出现采食量减少、腹部肿大等症状（杨星等，2014）。但喷浆玉米皮改变肠道菌群结构机制尚不明确，需进一步研究。

4 结论

饲料中添加喷浆玉米皮低于9%（粗蛋白质水平32%）时不影响班点叉尾鮰生长性能，但使肉色变黄。此外，添加喷浆玉米皮达到9%时斑点叉尾鮰肠道屏障功能被损坏，肠道有益菌相对丰度下降、有害菌相对丰度增加，因此在长期使用时需要进一步评估其价值。