单核细胞增生李斯特菌新型转录调节因子lmo2486的分子特征及原核表达研究

朱孝珍，刘昱诚，张星星，王立霞，季春辉，郭 蕴，才学鹏，孟庆玲，乔 军*

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003； 2 .新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆石河子 832003；3.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046)

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一种兼性胞内寄生菌，该菌可引发人和多种动物的李斯特菌病，尽管李斯特菌病病例较少，但其病死率很高，被认为是引起公共卫生问题的主要病原菌[1]。成年人的常见症状为头痛、胃痛、发热、腹泻和呕吐，但在高危人群，比如孕妇、婴儿、老人和艾滋病、癌症患者中可能会出现严重症状，如脑膜炎、败血症、流产甚至新生儿死亡[1-4],对于人致死率高达20%～30%[5]。在土壤、动物饲料、水以及哺乳动物和鸟类的粪便中都能发现单核细胞增生性李斯特菌，该菌能通过污染各种肉类和蔬菜、乳制品和即食食品从而导致李斯特菌病暴发[1]。此外，该菌可在高盐、低温、酸碱、高压和其他极端条件下存活[6-7]，有较强的环境适应性[8-9]。

LM感染、胞内生存和毒力受多种分子的调控，这些分子组成复杂的调控网络。现有研究发现，含有PspC结构域(噬菌体休克蛋白C)蛋白家族，广泛存在于多种病原微生物中。PspC蛋白是一种重要的转录调节因子，可参与细菌的应激反应系统及毒力相关基因的表达调控，可能与应激反应以及维持细菌细胞包膜的完整性密切相关[10]。然而，目前有关LM PspC家族成员的转录调节蛋白Lmo2486的生物学功能尚不明确。前期的生物学信息分析表明，Lmo2486蛋白具有PspC结构域。PspC结构域被认为是应激反应转录调节因子，可能与LM多个基因的表达调控密切相关[11-12]。同时，Lmo2486蛋白含有DUF4097结构域，该结构域为细菌黏附的可能结构元件。然而，lmo2486具体的生物学功能尚未深入研究。

为了进一步探究lmo2486基因的生物学功能功能，本研究对LM-SB5绵羊野毒株进行lmo2486基因克隆，对编码蛋白的结构进行分子特征分析，并进行了其遗传进化特征和表达研究，为揭示lmo2486在LM中对环境耐受和毒力的调控作用提供前期的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、培养基及试剂 LM-SB5新疆野毒株，由石河子大学预防兽医学实验室从发病绵羊体内分离，鉴定后保存。大肠埃希氏菌(E.coli) 感受态细胞DH5α，由石河子大学预防兽医学实验室保存。

1.1.2 培养基及试剂 脑心浸液培养基(BHI)，青岛高科技园海博生物技术有限公司产品；DNA标准DL 2 000、pMD19-T(simple)载体，TaKaRa公司产品；细菌DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，诺维赞生物公司产品；T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶HindⅢ、BamHⅠ、蛋白Marker，TaKaRa公司产品；IPTG，索莱宝公司产品；Trans8K DNA Marker、Transetta(DE3)，北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.3 仪器设备 超净操作台，BOXUN公司产品；恒温水浴锅(XMTD-8222)、隔水式恒温培养箱(DNP-9082)，上海精宏实验设备有限公司产品；移液器(2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL、5 L)，Eppendorf公司产品；高压蒸汽灭菌锅(HVE-50)，Hirayama公司产品；普通恒温培养箱(8000DH)、全自动酶标仪(Muitiskan GO)、高速冷冻离心机(Multifuge X1R)，Thermo Fisher公司产品；PCR仪、凝胶成像仪、转膜仪，Bio-Rad公司产品；电子天平(TP-213)，丹佛仪器(北京)有限公司产品；电泳槽(Power Wave XS2)，北京君意东方电泳设备有限公司产品；电泳仪(DYY-2C)、SDS-PAGE凝胶电泳仪(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank登录的lmo2486基因序列(登录号：CP023861.1)，设计扩增lmo2486基因特异性引物，上游引物lmo2486F：5′-ACAGACACCGGCAATAT-3′，下游引物lmo2486R：5′-CCGAATGCAGCTGATTCT-3′。由DNA Start软件分析的蛋白抗原表位集中区35～390，设计扩增lmo2486抗原集中区的特异性引物，32a1：CGGATCCATTTATATTATCATCACCAT，32a2：CCAAGCTTAATTCCATTTCCTACTTT，在引物32a1/2的5′端分别添加BamHⅠ和HindⅢ保护性碱基及限制性酶切位点(斜体及下划线部分)。送往北京华大基因公司合成。

1.2.2 LMlmo2486基因的克隆及测序 挑取LM-SB5单菌落于BHI培养基中，置于37 ℃振荡培养14 h～16 h，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取LM-SB5分离株基因DNA，以该DNA为模板，以设计的lmo2486基因特异性上、下游引物lmo2486F/R扩增lmo2486基因，PCR的反应体系为：PCR Mixture 10 μL，H2O 7 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL。 反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 10 min，共30个循环；4 ℃保存。将PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶在0.5×TBE电泳缓冲液中进行电泳，与DNA标准DL 2 000相比，将目的片段用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化。回收后的目的片段lmo2486基因与pMD19-T(simple)载体4 ℃过夜连接，然后转化到E.coliDH5α感受态细胞内，通过菌液PCR筛选阳性转化子，将阳性克隆送至华大基因生物公司测序。

1.2.3lmo2486基因编码蛋白质的生物信息学分析 通过Motif Scan在线软件分析糖基化位点、磷酸化位点等。利用在线软件ProtParam预测Lmo2486蛋白的理论分子质量及等电点；通过Protscale分析蛋白质的亲水性、疏水性；通过SignalP进行蛋白质的信号肽预测；利用软件SOPMA预测Lmo2486蛋白的二级结构；应用SWISS-MODEL预测蛋白质的三级结构；使用DNA Star预测蛋白的抗原表位集中区域；利用SMART预测并分析蛋白的结构域。

1.2.4lmo2486基因核苷酸序列遗传进化分析 将LM-SB5lmo2486基因与GenBank中公布的LM不同的菌株和PspC家族和DUF4097家族其他种属细菌的基因核苷酸序列进行同源对比，应用MEGA5.0软件对lmo2486基因核苷酸序列进行遗传进化分析，并采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树。

1.2.5 重组载体pET-32a(+)-lmo2486K构建 用引物32a1/2扩增lmo2486基因抗原表位集中区的片段并命名为lmo2486K，构建pMD19-T-lmo2486K，转化至DH5α中，筛选阳性克隆，用BamHⅠ和HindⅢ内切酶同时双酶切pMD19-T-lmo2486K重组质粒和pET-32a(+)载体质粒并将其回收，然后使用T4连接酶将pMD19-T-lmo2486K重组质粒和pET-32a(+)载体4 ℃过夜连接，转化至DE3中，进行菌液PCR和双酶切鉴定，将验证正确的质粒命名为pET-32a(+)-lmo2486K。

1.2.6 Lmo2486K的诱导表达及重组蛋白鉴定 将pET-32a(+)-lmo2486K重组质粒的转入DE3感受态细胞内，使用IPTG诱导蛋白表达，然后用120 g/L的SDS-PAGE验证蛋白的表达情况。同时，以小鼠抗His单克隆抗体为一抗，带有His标签的山羊抗鼠IgG为二抗，进行Western blot分析，鉴定表达的重组蛋白。

2 结果

2.1 lmo2486基因的扩增、克隆及测序

用特异性引物PCR扩增lmo2486基因，产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测得到1 212 bp的目的条带(图1)。胶回收与pMD19-T(simple)载体连接，转化到DH5α后通过菌液PCR筛选阳性转化子(图2)，进行测序分析，结果显示该基因序列与GenBank中公布的序列一致。

2.2 lmo2486基因核苷酸及其编码氨基酸序列分析

由GenBank中提供的序列可知，LM-SB5lmo2486基因全长1 212 bp，编码403个氨基酸。lmo2486蛋白含3个N-糖基化位点(137-140、201-204、317-320)，1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点(277-280)，10个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(8-11、65-68、66-69、193-196、206-209、241-244、279-282、321-324、348-351、396-399)，7个蛋白激酶C磷酸化位点(43-45、139-141、144-146、176-178、261-263、288-290、348-350)，5个N-豆蔻酰化位点(15-20、16-21、26-31、297-302、344-349)(图3)。

M.DNA标准DL 2 000;1.阳性对照；2～4.菌液PCR的产物

3个N-糖基化位点(阴影部分)，1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点(加粗部分)，10个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(下划线)，7个蛋白激酶C磷酸化位点(双下划线)，5个N-豆蔻酰化位点(方框)

2.3 Lmo2486蛋白的分子结构特征分析

通过在线软件分析表明，Lmo2486蛋白分子质量为64.6 ku，属于亲水性蛋白。利用在线软件SOPMA分析可知，Lmo2486蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成(图4A)。在线软件TMHMM Server v.2.0分析Lmo2486蛋白形成一个跨膜区(34-56)。SignalP 4.1 分析表明，该蛋白无信号肽。SWISS-MODEL预测该蛋白可形成桶状的三级结构(图4B)。SMART预测并分析发现，该蛋白质具有PspC 蛋白域(3-63)和DUF4097 蛋白域(140-361)(图4C)。

A.Lmo2486二级结构；B.Lmo2486三级结构；C.Lmo2486含有的主要结构域(PspC蛋白域位置：3～63，跨膜区：34～56，盘绕区：68～98，DUF4097蛋白域位置：140～361)

2.4 lmo2486基因序列的系统进化分析

将LM-SB5lmo2486核苷酸序列与LM不同分离株核苷酸序列以及同为PspC家族和DUF4097家族的不同菌种的基因进行同源性比对，结果显示，LM-SB5的lmo2486核苷酸序列与LM3株、02-6680株(4b型)、SLCC2378株(4e型)、ATCC 19117株(4d型)株、ICDC-LM188株、1/2b 10-0811株属于同一分支，与标准株EGD-e株的亲缘关系较近。与大肠埃希氏菌、阿尔多耶尔森氏菌( NZ-CP009781.1)、小肠结肠炎耶尔森氏菌株IP26014、亚历山大耶尔森氏菌株(NZ-CGBL01000009.1 )及马桑耶尔森氏菌株CCUG 53443属于不同分支，亲缘关系较远(图5)，表明lmo2486基因在LM中高度保守。

2.5 lmo2486表达载体pET-32a(+)-lmo2486K的鉴定

lmo2486抗原集中区片段长度为1 074 bp。将pMD19-T-lmo2486K双酶切，得到2 692 bp和1 074 bp大小的条带(图6)。重组质粒pET-32a(+)-lmo2486K双酶切得到5 900 bp的载体条带和1 074 bp的目的条带(图7)，表示成功构建了pET-32a(+)-lmo2486K重组质粒。

2.6 pET-32a(+)-lmo2486K重组质粒的诱导及蛋白的表达

将pET-32a(+)-lmo2486K转化至DE3感受态中，使用IPTG在16 ℃中振荡诱导Lmo2486的抗原集中区蛋白表达，经120 g/L SDS-PAGE检测出该重组蛋白的分子质量约是64.6 ku(图8)，并在20 h～24 h时表达量较多。Western blot以鼠抗His单克隆抗体为一抗，带有His标签的山羊抗兔IgG为二抗，在64.6 ku处有特异性反应条带(图8)，与预期值相符，分析lmo2486基因有着一定的反应原性，Lmo2486抗原集中区重组蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中表达成功。

图5 基于lmo2486基因核苷酸序列进行系统进化分析(NJ法)

M.DNA标准DL 8 000;1～2.pMD19-T-lmo2486K双酶切产物

M.DNA标准DL 8 000;1～5.pET-32a(+)-lmo2486K双酶切产物

3 讨论

LM是一种食源性胞内寄生的革兰氏阳性菌，也是李斯特菌属中致病力最强的细菌，可感染人和动物，并突破机体的血脑及血胎等生理屏障，引起脑膜炎和流产等多种疾病[13]。LM拥有复杂的调节网络，其中包括LM毒力因子的转录调控和对环境应激耐受力的调节等，其中pfrA是许多毒力基因的转录调控因子，sigB可调控多种环境应激相关基因的表达，在LM应激反应中发挥着重要的功能[14-17]。LMlmo2486基因是一种含有PspC结构域的新型转录调控因子，可能参与LM在致病力和环境应激时的转录调控过程。同时，该蛋白DUF4097结构域是构成细菌黏附素的重要元件，可能参与LM黏附宿主细胞的过程，推测与细菌毒力密切相关。然而，目前对LMlmo2486的研究较少，至今其生物学功能尚不清楚。

M.蛋白分子质量标准；1.蛋白上清液；2.pET-32a(+)空载体；3～9.IPTG诱导Lmo2486K蛋白0、4、8、12、16、20、24 h的表达产物；10.重组蛋白 pET-32a(+)-lmo2486K

PspC家族蛋白是一类应激反应调节因子，广泛存在于在革兰氏阴性肠杆菌科大肠埃希氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌中，主要参与细菌的应激反应和毒力的调节。目前研究发现，细菌的存活取决于它们感知和响应细胞包膜紊乱的能力。噬菌体休克蛋白(Psp)系统在包膜应激反应中起关键作用。在大肠埃希氏菌中，PspC家族蛋白参与应激反应系统以维持细菌细胞膜的完整性和功能[10,18]。PspC和PspB是两种细胞质膜蛋白，可以形成整合复合物，在小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌中作为Psp反应的感觉激活剂[19-20]。在乳酸乳球菌中，YthA蛋白是PspC家族的应激反应性转录调节因子，在氨基酸生物合成、嘧啶代谢和胞外多糖的生物合成中发挥了调控作用，同时YthA有助于耐酸性[18]。在小肠结肠炎杆菌中，小肠结肠炎耶尔森氏菌的Psp系统对毒力至关重要，PspC 缺失突变后毒力显著降低[19,21-22]，其生长也明显比野生型慢[21,23-24]。霍乱弧菌的Psp反应在压力源存在的情况下，内膜蛋白PspC可参与感知损伤[25]。PspC在肺炎球菌菌临床分离株中普遍存在，且PspC蛋白可以保护小鼠免受致命肺炎链球菌的攻击[26]。

本研究成功克隆了lmo2486基因并对其编码的蛋白进行了分子特征分析，发现其含有PspC结构域和DUF4097结构域。系统进化分析发现，该基因在LM中具有高度保守性。在此基础上，通过SDS-PAGE和Western blot证实重组蛋白Lmo2486K具有一定的反应原性，为揭示LMlmo2486对LM在环境应激和致病力调控作用奠定了前期的研究基础。