一株生防木霉的鉴定及环境pH与对羟基苯甲酸对其防病效果的影响

孙小涵，田彦梅，顾 欣 ，刘文辉，赵 岩，杨 娜

(宁夏大学 农学院，银川 750021)

西瓜枯萎病是西瓜的重要土传病害，病原菌是尖镰孢菌西瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveum，FON)。发病初期，植株萎蔫；发病后期，根部腐烂，整株枯死[1]。该病害对生产危害性大，可造成瓜田连片发病甚至绝收，且病原菌在土壤存活期长，对西瓜栽种具有持续性影响[2]。因此，有效防控枯萎病对保障西瓜生产具有重要 意义。

生物防控方法因对环境友好，成为当前土传病害防控的主要研究方向，高效生防菌的获得成为关键。木霉属(Trichodermaspp.)真菌种类丰富、分布广泛、环境适应性强，有广谱抗性，成为应用最广泛的生防真菌之一[3]。据报道，对致病性尖镰孢菌具有生防作用的木霉有哈茨木霉(Tharzianum)[4]、绿色木霉(T.viride)[5]、长枝木霉(T.longibrachiatum)[6]和康氏木霉(T.koningii)[7]等，抑菌机制涉及竞争作用、重寄生作用、抗生作用和诱导抗性作用等[8]。其中空间和营养竞争作用是木霉菌迅速形成根际生态优势、发挥抑菌作用的重要基础[9]。因此，分离筛选具有强竞争优势、能发挥高效生防作用的木霉菌株很有必要。

西瓜枯萎病在酸性和碱性土壤中均有发生，连作田中发病率更高[10]。研究表明，FON和木霉的生长均受环境pH的影响[11-12]。室内培养条件下，FON和木霉的最适生长pH范围分别为 4～9[13]和5.5～7.5[14]。土壤pH过高可导致FON和木霉的数量减少[15-16]。因此，环境pH直接影响生防木霉的防控效果。对羟基苯甲酸 (p-hydroxybenzoic acid，PHBA)是西瓜、水稻、甜瓜等多种作物根分泌物的重要组分[17-18]。西瓜连作可导致土壤中根分泌物积累，而对土壤微生物产生影响。研究表明，PHBA对FON的产孢、萌发及菌丝生长均具有“低浓度促进、高浓度抑制”作用[19]。ZHOU等[20]从营养角度探讨土壤中添加PHBA等有机物对木霉的影响，认为少量PHBA有提高土壤中木霉丰度的趋势。以上研究阐述了环境pH和PHBA对FON和木霉生长繁殖及拮抗效果的部分影响趋势，然而PHBA积累和pH双因素叠加对木霉生防效果的影响未见报道。

本研究对前期从宁夏西瓜根际土壤中分离的西瓜枯萎病生防木霉M3菌株进行鉴定，明确其分类地位；采用平板试验和盆栽试验，探明不同pH和PHBA质量浓度下FON和M3菌株的生长情况，明确pH与PHBA共同作用下M3菌株对FON的抑菌率及防病效果的变化规律，为研制高效的西瓜枯萎病生防菌剂及其有效应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

菌种：M3菌株和FON由宁夏大学农业微生物学实验室提供，分别从宁夏西瓜健康植株根际土壤和患病植株中分离获得。其中，FON经回接试验验证其为西瓜枯萎病病原菌，M3菌株为其拮抗菌。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培养基，用于菌种活化、对峙培养和菌种保藏；马铃薯葡萄糖(Potato dextrose，PDB)培养基，用于菌种液态发酵培养。

西瓜品种：‘金城五号’。

盆栽土壤：宁夏兴仁镇西瓜田旁边的非耕作土，取土深度距地表1～2 m，pH 8.3，过2 mm筛，备用。

1.2 方 法

1.2.1 M3菌株的分类鉴定 用PDA培养基 25 ℃，相对湿度65%倒置培养M3菌株，约6 d，菌丝长满平板(直径90 mm，下同)，转接于新的PDA平板，25 ℃，RH 85%，12 h光照/12 h黑暗倒置培养5 d，观察菌株同心轮纹的有无、颜色及形态特征。镜检菌丝、孢子梗和孢子形态特征。鉴定依据为Rifai[21]和Bissett[22]修订的木霉种群分类系统。

取活化4 d的M3菌落组织，用SDS法提取DNA[23]。以提取的DNA为模板，选用ITS(TCCTCCGCTTATTGATATGC)、延伸因子TEF1(CATCGAGAAGTTCGAGAAGG)、RPB2(TTGKAAAGAARCGTCTGGAT)[24]对M3菌株进行PCR扩增。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳并凝胶成像，切胶回收DNA片段。纯化的PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，获得M3菌株ITS、TEF1和RPB2基因序列。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中木霉属基因信息，通过MEGAX软件比对并手工矫正，构建M3菌株的系统发育树，确定其分类地位。

1.2.2 pH和PHBA质量浓度对FON和M3菌落生长的影响 采用两因素多水平试验。用过滤除菌的1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl将培养基pH分别调为5、6、7、8、9，添加PHBA使终质量浓度分别为0、50、100、200、400、800 mg·L-1，共制备30种梯度培养基。一部分用于最终pH的检测，其余制备梯度平板。在梯度平板中心打1个直径5 mm的孔，放入直径相同的M3或FON菌碟1个，28 ℃，RH 65%倒置培养60 h，测量菌落半径。每个处理设5个重复。

1.2.3 pH和PHBA质量浓度对M3菌株拮抗FON的影响 采用对峙培养试验。梯度平板制备方法同“1.2.2”。在梯度平板上打2个直径5 mm的孔，两孔相距3.5 cm，各放入1个FON和M3菌碟，培养条件同“1.2.2”。测量FON菌落半径，计算不同处理下M3菌株对FON的抑菌率。以不放M3菌碟为对照。每个处理设5个重复。抑菌率计算公式如下：

抑菌率=(对照FON菌株半径-对峙培养FON菌株半径)/对照FON菌株半径×100%

1.2.4 土壤pH和PHBA质量浓度对M3拮抗FON的影响 采用盆栽试验。将FON和M3菌株分别接种于PDB培养基，28 ℃，180 r·min-1培养5 d。血球计数板法检测孢子数量。用无菌水制备FON孢子悬液，浓度为6.7×103mL-1，M3孢子悬液浓度为107mL-1、108mL-1和109mL-1。土壤经121 ℃、30 min灭菌制成无菌土。用无菌 1 mol·L-1H2SO4和1 mol·L-1NaOH调节土壤pH分别为5、6、7、8、9，随后添加PHBA使土壤中PHBA质量浓度分别为0、50、100、200、400、800 mg·L-1，混合均匀。FON孢子悬液和无菌土以1∶1(质量比)混匀制成病菌土。M3孢子悬液和无菌土以1∶60(质量比)混匀制成M3接种土。每个营养钵(口径10 cm，底径 6.5 cm，高10 cm)装M3接种土300.0 g，均匀拌入病菌土3.0 g。每钵定植健康、1片真叶的西瓜幼苗1株。每7 d浇1次Hogland营养液4倍稀释液，每次每钵200.0 mL。根据土壤湿度，2～3 d每钵浇无菌水300.0 mL。保持充足光照，温度约20 ℃。每处理18株，培养30 d，记录瓜苗发病等级，计算发病率、病情指数和防治效果。

瓜苗发病等级标准：0级为茎内维管束内外无症状；1级为茎内维管束变色部分<25%；2级为茎内维管束变色部分25%～50%；3级为茎内维管束变色部分50%～75%；4级为茎内维管束变色部分>75%，部分叶片萎蔫；5级为整株萎蔫枯死。

发病率、病情指数和防治效果计算公式如下：

发病率=发病株数/调查总株数×100%

病情指数=∑(病级株数×代表数值)/(调查发病总株数×最高级值)×100

防治效果=(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100%

1.3 处理与统计分析

采用Microsoft Excel 2010软件处理数据并制作图表。采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析和相关性分析，在P<0.05水平上进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 M3菌株的形态学鉴定

菌株生长迅速，初为白色，卷毛状菌丝。随着培养时间增加，产孢簇逐渐变为绿色，老熟时呈暗绿色；分生孢子梗瓶状，较细且稍有弯曲，分枝呈轮状排列，大多1～3轮，较短且无分枝(图1-a，1-b)。分生孢子浅绿色，壁光滑，椭球形，(2.5～3.5) μm×(2.2～3.0) μm(图1-c)。培养96 h，菌落出现墨绿色与白色相间的同心轮纹(图1-d)，背面无色(图1-e)。培养7 d的菌落呈墨绿色，表面毡毯状，上有少量白色菌丝(图1-f)。依据形态特征，初步鉴定M3菌株为哈茨木霉(T.harzianum)。

a、b.分生孢子梗；c.分生孢子；d.菌落正面(培养96 h)；e.菌落背面(培养96 h)；f.菌落正面(培养7 d)；标尺为10 μm

2.2 M3菌株的分子生物学鉴定

将M3菌株ITS(登录号JX473715)、TEF1(登录号MT809679)及RPB2(登录号MT809710)序列在NCBI中进行比对，构建系统发育树如图2。M3菌株的ITS-TEF1-RPB2序列与哈茨木霉同源性达到100%。由此确定M3菌株为哈茨木霉。

图2 基于M3菌株 ITS-TEF1-RPB2序列构建的系统发育树Fig. Phylogenetic tree of strain M3 based on ITS-TEF1-RPB2 sequence analysis

2.3 pH和PHBA质量浓度对FON和M3菌落生长的影响

PDA培养基初始pH 6.4。添加PHBA后，培养基pH与初始值相比未发生变化或变化不显著。因此，添加PHBA视为对培养基pH无影响。

如图3，培养基pH和PHBA质量浓度对FON和M3菌落生长具有不同影响。在PHBA质量浓度相同时，FON菌落半径由大至小为pH 8>pH 7>pH 9>pH 6>pH 5，M3菌落为pH 6>pH 5>pH 7>pH 8>pH 9。两菌株都存在最适生长pH，分别为8和6。当pH相同时，随着PHBA质量浓度增加，两菌的菌落半径均呈现先增加后降低的现象，但是菌落半径峰值对应的PHBA质量浓度不同。50 mg·L-1处理的FON和M3菌落半径较对应的CK分别增加1.64%～2.45%和0.62%～1.19%，100 mg·L-1处理分别增加3.84%～4.13%和1.58%～2.20%，200 mg·L-1处理分别增加6.56%～7.81%和 3.23%～3.93%，400 mg·L-1处理分别增加 -3.76%～-2.52%和6.56%～7.64%，800 mg·L-1处理分别增加-12.89%～-7.14%和 -7.19%～-5.04%。FON菌落在PHBA 200 mg·L-1处理中生长最佳，高于或低于该值的处理，菌落半径显著降低，且pH 5～9时变化趋势在各组内表现一致。M3菌株也有类似规律，但是其菌落在400 mg·L-1处理中生长最佳。由此可知，FON最适生长条件为pH 8，PHBA质量浓度200 mg·L-1；M3菌株最适生长条件为pH 6，PHBA质量浓度400 mg·L-1。说明M3菌株较FON更喜弱酸性环境，对PHBA积累环境的适应能力强于FON。

a.FON菌落半径；b.M3菌落半径a.FON colony radius; b.M3 colony radius

单独培养时，M3菌落的生长速度显著高于FON。在M3菌株生长最适宜的pH 6、400 mg·L-1处理中，M3菌落半径较FON多 127.11%，达3.47 cm(最高值)；在FON生长最适宜的pH 8、200 mg·L-1处理中，M3菌落的半径仍然较FON多93.15%，为2.99 cm(最低值)。说明M3菌株在生长速度上较FON具有显著优势。

2.4 pH和PHBA质量浓度对M3拮抗FON的影响

将FON和M3菌株对峙培养，在pH、PHBA和M3菌株的共同作用下，FON菌落生长变化趋势与非对峙培养相似。如图4-a，FON菌落半径的峰值仍然位于200 mg·L-1，且pH 8最有利于FON生长。但是在M3菌落的影响下，FON生长受到显著抑制。pH 8、200 mg·L-1处理的菌落半径峰值仅为1.20 cm，较对应的单独培养降低62.62%；pH 5、800 mg·L-1处理的菌落半径最低，仅为0.85 cm，较单独培养降低 64.14%。由图4-b可知，在pH 5～9、PHBA质量浓度0～800 mg·L-1时，M3菌株对FON的抑菌率为62.60%～65.80%，没有显著波动。说明pH和PHBA共同作用下，M3菌株的抑菌率无显著变化。

图4 不同pH和PHBA质量浓度对M3菌株拮抗FON的作用Fig.4 M3 antagonizing FON under effects of pH and PHBA mass concentration

2.5 土壤pH和PHBA质量浓度对M3生防效果的影响

由表1可知，不同土壤pH和PHBA质量浓度影响下植株的发病率、病情指数具有差异，M3菌株对西瓜枯萎病的防治效果也不同。pH 9、未添加PHBA与pH 8、800 mg·L-1两个处理的发病率最高，均为77.78%。以pH 9、未添加PHBA为对照，计算其他各处理的防治效果。经对比可知，除pH 6外，在同一pH组中，PHBA 400mg·L-1处理的植株发病率和病情指数均为最低，M3菌株的防治效果均为最高。在pH 6组中，除高质量浓度800 mg·L-1显著影响防治效果外，其他各处理均具有最高水平的防治效果，达85.72%。在pH 8～9组中，未添加PHBA及800 mg·L-1处理的植株发病率、病情指数均为组内较高水平，而M3菌株的防治效果均为组内较低水平。

表1 不同土壤pH和PHBA质量浓度下M3菌株对西瓜枯萎病的防治效果Table 1 Control effect of M3 on watermelon wilt under different soil pH and PHBA mass concentration

表2 土壤pH和PHBA质量浓度与M3菌株防治效果的相关性Table 2 Correlation analysis of soil pH and PHBA mass concentration and control effect of M3

2.6 土壤pH和PHBA质量浓度与M3菌株防治效果的相关性分析

根据皮尔逊相关性分析可知，土壤pH与发病率、病情指数和防治效果均具有极显著相关性，即pH越高，枯萎病发病率和病情指数越高，而防治效果越受到抑制。PHBA质量浓度与病情指数具有显著相关性，但是与发病率和防治效果的相关性不显著。由此可知，M3菌株的防治效果主要受土壤pH的影响；PHBA的积累主要影响病情指数。

3 讨 论

本研究明确了真菌M3菌株为哈茨木霉。利用哈茨木霉防治西瓜枯萎病一直被学者们所关注[25]。田程等[26]分离获得一株对西瓜枯萎病菌具有生防作用的哈茨木霉T2-16，抑菌率 60.00%。木霉菌的菌丝体通常生长迅速，有利于与病原菌进行空间和营养竞争[27]。在本研究中，M3菌株表现出较强的竞争能力，于不同pH和PHBA含量的环境中，其生长速率均显著高于FON，使FON菌落半径较CK减少62.60%～65.80%，表明M3菌株具有较强的竞争优势，对FON具有较好的抑菌能力。

环境pH作为非营养因素可直接影响真菌的生长、繁殖及与其他生物的关系[28]。通常，木霉和尖镰孢菌生长的最适pH分别为3～7和 4～9[29-30]。本研究获得与此相似的结论，哈茨木霉M3菌株和FON的最适pH分别为6和8，为在实际生产环境中利用M3菌株开展生物防治提供了依据。

PHBA是植物根系分泌的一种酚酸类物质，可以被微生物分解利用[31]。郝文雅等[17]研究表明，PHBA对FON菌丝生长、产孢和孢子萌发具有促进作用，其最适PHBA质量浓度为400～800 mg·L-1。本研究获得相似的结论，FON菌株生长具有最适PHBA质量浓度，但该菌株为200 mg·L-1，可能是不同菌株生物学特性差异所致。同时，研究发现PHBA对哈茨木霉M3的菌丝生长具有低浓度促进、高浓度抑制的作用，最适PHBA质量浓度400 mg·L-1。Chen等[32]认为哈茨木霉对PHBA具有较强的降解能力。对比可知，哈茨木霉M3菌落生长的最适PHBA质量浓度显著高于FON，说明其对PHBA积累环境具有较好的耐受性。这可能与M3菌株对PHBA的降解和利用能力较强有关。哈茨木霉和病原菌对PHBA利用能力差异性的机制研究有待进一步探索。

连作土壤环境复杂。土壤中根系分泌物PHBA积累与pH共同作用于根系和根际微生物，故考虑两种因素对生防木霉的叠加作用。作为探索，试验设计的PHBA质量浓度范围涵盖并超过实际连作土壤的情况[33]，但是M3菌株的抑菌率几乎未受PHBA质量浓度变化的影响。盆栽试验验证了室内研究结果，M3菌株在土壤pH 6、PHBA质量浓度低于800 mg·L-1的环境中对西瓜枯萎病的防治效果最佳。Abeyratne等[34]研究表明土壤pH为6时，木霉产生大量抗真菌化合物如几丁质酶等，形成较强的拮抗能力，对植株幼苗生防效果最佳。但是，随着土壤pH增加，M3对西瓜枯萎病的防治效果有降低趋势。可能在高pH土壤中，木霉调节转运蛋白、信号相关蛋白、胞外酶和参与各种代谢反应的蛋白质的基因，降低了木聚糖酶、纤维素酶和半纤维素酶等的活性，并阻碍膜运输蛋白的运输能力，影响了其对病原菌的防治效果[35]。相关性分析也表明，土壤pH较PHBA对M3生防效果的影响更为显著。因此，酸性土壤条件更有利于M3菌株的生防 作用。

研究表明，土壤pH增加可促进镰孢菌对植株的侵染，导致植株发病率增高[36]。本研究发现，pH 8、PHBA 800 mg·L-1和pH 9、未添加PHBA两组处理的发病率最高，并非预期的pH 8、200 mg·L-1。说明在植株根际环境，FON对植株的侵染主要受土壤pH的影响。原因可能是土壤pH诱导FON产生胞外酶降解植物细胞壁，同时促进蛋白酶、脂肪酶等毒力因子的分泌，致使植株发病率升高[37]。PHBA对西瓜枯萎病病情指数具有一定影响，相关机制有待深入研究。

4 结 论

经形态学和分子生物学鉴定，确定M3菌株为哈茨木霉。在培养基中，M3菌株和FON均存在最适pH和最适PHBA质量浓度，分别为6、400 mg·L-1和8、200 mg·L-1。在pH和PHBA共同作用下，M3菌株对FON的抑菌率稳定在62.60%～65.80%；土壤环境中，M3对西瓜枯萎病的防治效果达85.72%，主要受环境pH的影响。总之，该菌株具有较好的生防应用潜力，研究结果为相关菌剂的研制与应用奠定了基础。