水稻芽期抗旱性综合评价及鉴定指标鉴选

李其勇,朱从桦,李星月,武丙琳,易 军,符慧娟,陈德西,张 鸿

(1.四川省农业科学院 植物保护研究所/农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，成都 610066; 2.四川省农业科学院 作物研究所，成都 610066)

水稻是中国乃至世界上最重要的粮食作物之一，其生产耗水量居各类作物生产用水量之首，约占农业用水量70%左右[1-3]。据统计，水稻整个生育期约耗水8884.4m3/hm2，其中田间稻株蒸腾和棵间蒸发量达72.31%[4]。传统淹灌栽培方式下水稻生产耗水量大，加剧农业生产与水资源短缺的矛盾。干旱已成为阻碍中国以及世界谷类作物生产的主要非生物胁迫因素之一[5]。干旱胁迫对水稻芽期[6]、苗期[7-8]、分蘖期[9]、抽穗期[10]、成熟期[11-12]等各时期均有不同程度的负面影响，造成水稻出苗困难、分蘖不足、生长势减弱、光合作用受抑、产量降低、品质变劣等多方面不利后果。从应对干旱风险来说，筛选优质抗旱水稻品种是解决水稻抗旱性栽培最重要、最有效的手段。由于水稻抗旱的复杂性、受环境影响的多变性，抗旱性鉴定方法、指标并不统一，利用综合分析方法继续开展抗旱品种筛选并鉴选一批简单易测、通用性强、抗旱性预测效果准确的指标显得十分 必要。

近年来，不少学者针对水稻芽期[6,13]、苗期[14-16]、穗分化期[17]、花期[18]、成熟期[19]等各主要生育期筛选了部分抗旱指标以及抗旱品种(材料)。相较于苗期和大田抗旱鉴定，芽期鉴定方便、耗时短、容量大。在芽期抗旱研究方面，王贺正等[6]提出可用相对胚根长、相对芽长、相对芽干质量作水稻芽期抗旱性鉴定指标，而相对根干质量因变异较大而不适于品种间选择；田又升等利用主成分分析指出胚芽干质量、发芽率、胚芽鞘长和根冠比可作为水稻萌发期抗旱性鉴定的主要指标[20]；敬礼恒等[21]指出相对发芽率、相对芽长、相对胚根长、相对根芽干质量可作为水稻种子萌发期的抗旱性评价指标；王秋菊[22]指出储藏物质转运速率、根系活力和β-淀粉酶活力可以作为衡量水稻品种耐旱性强弱的有效生理指标；杨瑰丽等[13]指出芽鞘长和最长根长适合用作水稻萌发期抗旱鉴定指标；安永平等[23]认为萌发胁迫指数和芽鞘长的干旱胁迫反应指数(DRI)可作为评价水稻芽期抗旱性的间接鉴定指标。可见，不同研究者提出的抗旱鉴定指标并不完全相同。

PEG(聚乙二醇)在牧草[24]、小麦[25]、水稻[26]、玉米[27]等各类作物抗旱性研究中应用广泛，可作为良好的干旱胁迫渗透剂。在大田条件下开展抗旱性鉴定评价易受环境影响，工作量大，而在芽期开展抗旱性鉴定可较好避免大田鉴定不足之处，同时芽期生理指标研究较少，因此，在芽期纳入生理指标进行抗旱性综合分析、指标鉴选，进一步探讨芽期抗旱鉴定方法。本研究以不同水稻品种为材料，利用PEG在芽期进行种子萌发干旱胁迫，观察不同水稻品种抗旱性表现差异情况，比较分析不同品种对干旱胁迫响应的差异，并通过综合评价，筛选水稻芽期抗旱性鉴定指标，并筛选具有较强抗旱性的品种，为水稻进行抗旱性快捷评价及品种生产应用、节水抗旱高产栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取四川省水稻品种20个，具体见表1。

表1 参试品种名称及编号Table 1 Name and number of tested varieties

1.2 试验设计

试验于2018-01-03在四川省农业科学院植物保护研究所恒温光照培养室进行。采用PEG-6000(聚乙二醇)溶液作为干旱胁迫介质，其溶液浓度按质量体积比配制，经前期预试验选择，设20%浓度为干旱胁迫处理，以蒸馏水为对照(CK)。每品种选择饱满种子400余粒，用75%酒精表面消毒45 s，用蒸馏水润洗3次后加蒸馏水(淹没种子)于28 ℃恒温培养室中浸种24 h，后取出用蒸馏水润洗两次，放入直径90 mm垫湿润滤纸的培养皿内于28 ℃催芽。待种子露白后，取出用滤纸吸干表面水分后，将种子均匀摆进直径为90 mm底部垫有圆形滤纸的培养皿中，每皿50粒，处理组每皿加入8 mL 20%PEG-6000溶液，对照组加入8 mL 蒸馏水，每处理3次重复。盖上盖置于恒温光照培养室中发芽，保持恒温 28 ℃，光照周期为8 h/16 h(光照/黑暗)，光强为200 μmol/(m2·s)。每天观察培养皿内液体的变化并根据第1天每皿液体量酌量添加蒸馏水，保持培养皿液体恒定。从种子置床之日起开始观察，以胚根突破种皮1 mm、胚芽为种子长度1/2为发芽标准，逐日定时测定发芽种子数。第10天收获幼苗，保存于-20 ℃冰箱，待测生理指标。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 发芽势(Germination potential,GP)、发芽率(Germination rate，GR) 以第3天和第8天每皿发芽种子数除以每皿总粒数即为发芽势及发芽率。

1.3.2 发芽指数(Bud index，BI)BI= ∑(DG/DT)，DG为逐日发芽数，DT为相应DG的发芽时间。

1.3.3 活力指数 (Vitality index，VI)VI=BI×(芽长+最长根长)，BI为种子发芽指数。

1.3.4 种子萌发指数 种子发芽指数(Germination index，GI) GI=(1.00)nd2+(0.75)nd4+(0.50)nd6+(0.25)nd8，其中nd2、nd4、nd6、nd8分别为第 2、4、6、8天的种子萌发率，1.00、 0.75、0.50、0.25分别为相应萌发天数所赋予的权重系数。萌发抗旱系数(Germination drought resistance index，GDRI) =干旱胁迫下种子萌发指数/对照种子萌发指数。

1.3.5 根、芽性状 于处理后的第8天在各培养皿内随机选取5 棵已发芽的种子，测量各种子的芽长、最长根长、根数，并分根、芽、剩余种子三部分分别称量鲜质量，分装后于烘干箱105 ℃杀青0.5 h，80 ℃烘至恒质量后称量干质量。

1.3.6 根芽比(Root-shoot ratio，RSR) 根芽比(RSR)=根干质量/芽干质量。

1.3.7 储藏物质转化率(Storage material conversion rate，SMCR) 储藏物质转化率(SMCR)=(芽干质量+根干质量)/(芽干质量十根干质量十剩余种子干质量)。

1.3.8 幼苗相对含水量(Seedling relative water content，SRWC) 相对含水量(SRWC)=(幼苗鲜质量-幼苗干质量)/幼苗鲜质量×100%。

1.3.9 生理指标 测定淀粉酶、可溶性糖含量、脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性，其中MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性采用上海源叶生物技术有限公司ELISA测试盒测定，其余指标采用苏州科铭生物技术有限公司的相应指标试剂盒以微量法测定。

除萌发抗旱系数(已是相对值)外，各性状数据均以相对值表示：指标相对值=胁迫指标测定值/对照指标测定值。为便于描述，所有指标名称均表示各指标相对值。

1.4 隶属综合评价法

数据标准化处理公式：正向指标：μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

负向指标：μ(Xj)=1-(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

其中，j= 1,2,3,… ，n；Xj表示第j个指标值；Xmin表示第j个指标的最小值；Xmax表示第j个指标的最大值，如某一个指标与抗旱性为负相关，则采用公式(2)计算，计算出各品种各指标的隶属值。采用标准差系数法计算权重系 数Wj：

(3)

(4)

其中，j= 1,2,3,… ,n；MFSV为隶属函数综合值(Membership function synthetic value)，隶属函数综合值越大，表示抗旱性越强。

1.5 分级评价法

在借鉴高吉寅等[28]、王贺正等[6]的划级方法基础上加以改进。

计算分级系数：

(5)

其中，n为指标个数；m为分级级数。GC代表参试品种的分级系数(Grading coefficient)，值越大则综合抗旱性越强。

1.6 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2007整理试验数据，采用DPS14.05进行方差分析(Duncan新复极差法)、相关性分析、主成分分析，采用SPSS 24.0进行聚类分析。

UCT算法在不同的深度获取评估值。根据算法具体设计逻辑，在执行过程中，先评估分支的“希望”值，值越高，然后UCT算法的搜索深度越深 （远大于 d），结果能较大限度的拟合最优解[2]；相反，值越低，丢弃的可能性越大。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对水稻芽期萌发的影响

对测定的23个指标进行方差分析(表2)。可以看出，脯氨酸含量在品种间、根芽比在干旱胁迫间、根数和可溶性糖在品种与干旱胁迫互作间无显著性差异，除此外，所有指标在品种间、干旱胁迫间以及品种与干旱胁迫互作间均有显著性或极显著性差异。表明采用20% PEG-6000作为干旱胁迫处理浓度，20个参试品种在干旱胁迫作用下产生了显著变化，可以较好地比较水稻品种间的抗旱性强弱。

表2 干旱胁迫下水稻各指标方差分析表(F值)Table 2 Variance analysis of rice indices under drought stress(F value)

2.2 干旱胁迫下水稻芽期各指标相关性分析

从表3可以看出，芽期萌发、生长指标间相关性较高，多达显著水平，而生理指标间相关性较弱，较少达显著水平。对于发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、萌发抗旱系数5个萌发相关的指标来说，指标间均呈极显著正相关，萌发抗旱系数与发芽指数相关性最强(r=0.967**)，发芽率与发芽指数、活力指数、萌发抗旱系数的相关性弱于发芽势。表明相对于发芽率，发芽势更能反映干旱胁迫下种子萌发抗旱性强弱。对于生长相关指标来说，芽长、芽干质量、储藏物质转化率、幼苗相对含水量4个指标间均呈显著或极显著正相关，且均与前述5个萌发相关指标呈显著或极显著正相关；芽长与最长根长、根干质量显著正相关(r=0.606**、0.492*)，表现出根芽同伸的关系。表明这4个生长相关指标间在干旱胁迫下关系较密切。对于生理指标来说，MDA、可溶性糖、脯氨酸与绝大部分萌发、生长、生理指标呈负相关性，其中，脯氨酸含量与发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、萌发抗旱系数、芽长、根干质量、储藏物质转化率、幼苗相对含水量均呈显著或极显著负相关，表明脯氨酸含量变化与干旱胁迫下种子萌发生长表现关系较为紧密。α-淀粉酶活性、总淀粉酶活性、β-淀粉酶活性间均呈极显著正相关，均与根干质量极显著正相关，表明较强的淀粉酶活性可促进根系物质转化利用，提高根系物质积累量。

表3 干旱胁迫下水稻各指标的相关性分析Table 3 Correlation analysis of rice indices under drought stress

2.3 干旱胁迫下水稻芽期抗旱性分级法综合分析

采用四级分级法对20个品种进行抗旱性综合评价(表4)。可以看出，各指标的级别值主要为2、3级，1、4级相对较少，采用标准差S作为分级标准，最强和最弱的指标值分布较少，多数指标值分级居于最强、最弱之间。

表4 水稻品种芽期干旱下各性状相对值及分级系数Table 4 Relative values and grading coefficients of traits under drought stress at the germination stage of rice varieties

按照分级系数GC大小对品种进行排序，‘冈优99’‘德香4923’‘川优6203’‘内6优138’‘川香优6号’5个品种分级系数GC大于0.6，分列前5名，为抗旱性较强的品种；‘宜香2115’‘宜香2079’‘泸优137’‘宜香3724’‘宜香907’分级系数GC小于 0.45，排名后5位，抗旱性相对较弱；其余品种居中。

2.4 干旱胁迫下水稻芽期隶属函数法综合分析

利用隶属函数法对所有指标进行综合分析，以标准差系数法求每个指标的权重，具体见表5。对隶属函数综合值MFSV进行排序，‘冈优99’‘川优6203’‘德香4923’‘内6优138’‘福伊优188’5个品种分列抗旱性综合排名前5位，综合抗旱性较强；‘花香7021’‘宜香2079’‘泸优137’‘宜香3724’‘宜香907’的隶属综合值小于0.45，排名后5位，抗旱性相对较弱。评价结果与分级系数较为一致。

表5 水稻品种芽期干旱下各指标隶属值、隶属函数综合值及抗旱性排名Table 5 Membership function value，MFSV and drought resistance rank of rice varieties under drought stress at germination stage

2.5 干旱胁迫对水稻芽期萌发指标主成分分析

对23个指标进行主成分分析(表6、表7)，共提取了7个特征值大于1的新主成分因子，累计贡献率达87.20%，基本上代表了23个原始指标的大部分信息。

表6 各指标主成分分析(7个因子)的特征向量及方差累计贡献率Table 6 Eigenvectors and accumulative contribution rate in principal component analysis of each index(7 factors)

根据提取的7个主成分特征向量及标准化的指标相对值，分别计算每个主成分的综合得分值(PCASV，Principal component analysis synthetic value)(表7)，并用隶属函数法计算每个品种每个主成分指标隶属值，同时以主成分贡献率计算指标所占权重，最后计算出每个品种的综合得分值(PCASV值)，并对品种抗旱性进行排名，PCASV值越大的品种其抗旱性越强。可以看出，‘川优6203’‘冈优99’‘冈优900’‘川香308’‘福伊优188’的主成分综合值大于0.62，分别排在前5名，综合抗旱性较强，‘花香7021’‘H优523’‘宜香2079’‘宜香907’‘宜香3724’排名后5位。

表7 主成分分析7个因子得分、隶属值、综合值及排名Table 7 Scores，membership values，PCASV and rankings in principal component analysis of 7 factors

2.6 综合评价方法相关性分析

对分级系数、隶属函数综合值、主成分综合值3种综合评价值进行相关性分析(表8)。可以看出，3个综合分析方法结果均达极显著正相关，分级系数与隶属函数综合值相关系数最高 (0.962**)，二者评价结果较为一致，而主成分综合值评价结果稍差。

表8 水稻品种芽期干旱胁迫下综合指标相关性分析Table 8 Correlation analysis of comprehensive indices under drought stress at germination stage of rice varieties

2.7 水稻芽期抗旱性鉴定指标筛选

从表9可以看出，储藏物质转化率与分级系数、隶属函数综合值的相关系数分别为0.913**、0.901**，指标本身反映了种子萌发阶段物质转化利用状况，根、芽干物质积累量越高则此指标大，因此，可作为水稻芽期抗旱性评价的首选单项指标；活力指数、萌发抗旱系数、芽长、芽干质量与分级系数、隶属函数综合值均极显著正相关，可作为抗旱性评价的备选单项指标；发芽势、发芽率、幼苗相对含水量相对值的变异系数较小，脯氨酸测定较复杂，发芽指数与主成分综合值无显著相关，不建议作为鉴定指标。分级系数、隶属函数综合值较为全面反映了各品种芽期综合抗旱能力，评价更准确，但工作量相对更大，计算更为复杂，可作为抗旱性评价的精确鉴定指标。

表9 干旱胁迫下各指标与萌发生长及综合指标相关性分析Table 9 Correlation analysis of each index and germination growth and comprehensive indices under drought stress

2.8 新筛选指标评价结果比较

利用筛选出的活力指数、萌发抗旱系数、芽长、芽干质量、储藏物质转化率5个指标进行隶属函数及分级法分析，并与单项指标及综合指标进行相关性分析(表10)。可以看出，采用5个鉴定指标计算的分级系数、隶属函数综合值与原所有指标的分级系数、隶属函数综合值相关系数分别为0.923**、0.880**，其中，这5个指标在隶属函数分析中权重合计仅占所有指标权重的18%，在分级法中各品种5个指标分级值和占其总分级值的15.6%～26.4%，占比不高但评价结果高度相关，说明采用筛选出的5个指标进行综合评价与所有指标综合评价结果基本一致。5个鉴定指标的分级系数、隶属函数综合值与活力指数、萌发抗旱系数、储藏物质转化率均极显著相关。表明，采用筛选出的5个指标可以较好地评价参试品种抗旱性。

表10 5个干旱鉴定指标综合评价结果与单项及综合指标相关性分析Table 10 Correlation analysis between comprehensive evaluation results of five drought identification indices and individual， comprehensive indices

2.9 参试品种抗旱性聚类分析

利用储藏物质转化率、活力指数、萌发抗旱系数、芽长、芽干质量、隶属函数综合值、分级系数7个指标以组间联接-平方欧氏距离进行聚类分析(图1)。可以将20个参试品种划分为5大类抗旱性不同的类群，其中，‘冈优99’为一类，抗旱性最强；‘德香4923’‘内6优138’‘川香优6号’‘川优6203’聚为一类，抗旱性较强；‘泸优137’‘宜香3724’‘宜香2079’聚为一类，抗旱性较弱；‘宜香907’为一类，抗旱性弱；其余品种聚为一类，抗旱性居中。

图1 品种抗旱性综合聚类分析Fig.1 Comprehensive clustering analysis of drought resistance of varieties

3 讨 论

3.1 水稻芽期抗旱性鉴定指标筛选

水稻抗旱性是多基因控制的数量性状，具有丰富的遗传背景和复杂的分子机理[29-30]。不同研究者对水稻种子芽期抗旱性鉴定指标研究结果并不完全相同，芽期的形态生长及生理指标都在一定程度上反映了水稻芽期抗旱性强弱，但鉴定指标仍不统一。在本研究中，绝大多数品种发芽势相对值在85%以上，发芽率相对值在95%以上，发芽势受抑程度高于发芽率，同时，芽长受抑程度高于最长根长，芽长、最长根长、芽干质量等生长相关指标的相对值低于发芽势、发芽率、萌发抗旱系数等萌发相关指标，这与田又升等[20]、李艳等[31]研究结果较为一致。表明水稻种子萌发时遭受干旱胁迫时，会推迟萌发时间，但对发芽率抑制作用较小，干旱胁迫对芽长、根长、物质消耗的抑制作用较萌发相关指标更强。研究指出，干旱胁迫对水稻种子萌发存在时间效应，20%PEG胁迫下水稻种子在第6天的相对萌发率变异系数高于第8天的[23]，随着萌发时间延长，种子萌发率得以提高，导致干旱胁迫效应减小甚至无差异。因此，采用发芽相关指标作为评价指标有待进一步探讨。本研究认为，相较于萌发相关指标，根芽生长发育可能更能反映出干旱胁迫对种子芽期萌发的影响。结合相关分析，储藏物质转化率与分级系数、隶属函数综合值相关系数为所有指标中最高，主成分分析中在第一主成分载荷最高，其在干旱胁迫、品种及干旱胁迫和品种互作间均达极显著水平，同时反映了种子萌发过程中物质的转化、利用和根芽干物质积累能力，其值越高表明种子萌发时种子胚乳物质转化利用越多，根芽物质积累量越高，根芽生长越健壮，因此可作为芽期抗旱性评价首选指标。活力指数由发芽指数与根芽性状共同决定，包含了萌发和生长两方面信息，其与分级系数、隶属函数综合值相关系数分别为 0.847**、 0.810**，次于储藏物质转化率，可作为抗旱性鉴定指标，在谷子和玉米的研究中也有相似结果[32-33]。萌发抗旱系数在多数研究中作为芽期抗旱鉴定指标得到了较多认可，本研究中与其他萌发生长相关及综合指标显著相关，可作为鉴定指标。芽长、芽干质量密切相关，均直接反映了种子萌发芽部生长情况，与萌发生长、综合指标显著相关，可作为鉴定指标，这与李艳的结果一致[31]。综上，储藏物质转化率、活力指数、萌发抗系旱数、芽长、芽干质量可以作为水稻种子芽期抗旱性鉴定指标，分级系数、隶属函数综合值可作为抗旱性精确鉴定的指标。

3.2 水稻芽期抗旱性鉴定方法比较

干旱胁迫下，作物会产生一系列复杂的生理生化变化，并带来形态上的改变，对干旱胁迫响应包含了形态、生理生化等多方面的信息，因此，采用单一指标进行评价会导致评价结果片面化，甚至不准确，造成抗旱评价中部分重要指标信息缺失。目前认为通过多指标综合评价方法更能准确反映作物抗旱性，可以纳入干旱胁迫对植株形态、生长、生理等影响的更多信息进行抗旱性综合评价。应用隶属函数法、主成分分析法、灰色关联度分析法、干旱划级法等[31，34-35]综合评价法进行评价准确性更好，在水稻[36-37]、大豆[38-39]、玉米[40]、油菜[41]等多种作物上均有应用，筛选出了一批具备一定抗旱能力的优质品种、材料，实际应用效果较好。本研究采用了隶属函数法、主成分分析法、干旱分级法3种综合评价方法分别进行了品种抗旱性评价，3种评价方法综合评价结果相关性均达极显著强相关，结果较为一致。因此，利用综合评价法可以较好地评价水稻芽期抗旱性。隶属函数法进行综合评价应用较广，符合多指标评价要求，改进的分级系数应用效果较好。

3.3 分级系数的应用

在水稻抗旱性评价中，高吉寅、王贺正、王秋菊等应用了分级法进行抗旱性评价[6，28，42]，其分级标准由人为划分，存在不确定性。本研究对分级法进行了改进，建立了以标准差为分级标准的数学方法，提出了新的综合评价指标，即分级系数，研究表明应用效果较好。该分级评价方法具有如下特点：(1)建立了整套评价方法计算公式，正负向指标均可，可直接对指标值进行依序计算，最终得出综合评价值；(2)以数学方法进行分级，不受数据大小、量纲限制，均可按公式统一计算得到相应分级值，排除了人为分级的主观性，保证了计算过程的客观性；(3)分级系数位于0到1的闭区间，数值大小适中，且不会因指标个数增减而大幅变化；(4)传统分级值越大表示抗旱性越弱，而本评价方法的分级系数越大代表抗旱性越强，符合人们思维习惯；(5)本分级评价方法具有广泛通用性，在不同试验、不同材料、不同抗性评价(抗盐、抗高温、抗低温等)中均可应用，可比性较强。从本研究结果来看还有两点值得探讨：(1)以标准差作为分级标准，使得大部分性状值被分至2、3级，以0.5S作为分级标准各性状值分布更为分散，则到底选用多大倍数标准差作为分级标准而让分级值分布更合理有待思考；(2)综合分级值是以各指标分级值相加而得出，是否应根据相对值计算标准差系数赋予权重，再行计算分级系数。以上两点还有待进一步发展完善，以更科学合理地应用本方法。

4 结 论

对水稻品种进行芽期干旱胁迫下，利用各指标相对值进行相关性分析、综合分析，筛选出储藏物质转化率、活力指数、萌发抗旱系数、芽长、芽干质量可以作为水稻芽期抗旱性鉴定指标。

综合分析中，隶属函数法和分级法相较主成分法效果较好，因此，分级系数、隶属函数综合值可作为芽期抗旱性精确鉴定的指标。可采用分级法、隶属函数法进行综合分析。

对比综合分析结果排序及聚类分析结果，‘冈优99’‘德香4923’‘内6优138’‘川香优6号’‘川优6203’5个品种综合抗旱性较强。