印度梨形孢定殖策略和促生机制研究进展

武明雅，陈俊强，马海林，刘方春，刘丙花，刘幸红，司东霞

（1聊城大学农学与农业工程学院，山东聊城 252000；2山东省林业科学研究院，济南 250014）

0 引言

印度梨形孢(Serendipita indica)是一种内生真菌，属于担子菌门，由印度科学家VERMA等[1]在印度塔尔沙漠的灌木根中分离得到。印度梨形孢定殖范围十分广泛，目前已知印度梨形孢可以与12个科约150种植物建立共生关系，包括非菌根植物和丛枝菌根真菌不能定殖的十字花科植物中[2]。

印度梨形孢最大的特点在于能与寄主植物共生，缓解植物受到的生物胁迫和非生物胁迫，通过各种不同的方式促进植物生长发育，提高花朵、种子或果实产量，改善其品质。同时，印度梨形孢起到生物肥料和生物修复剂的作用，改善土壤营养、修复土壤污染状况[2]。但由于植物-微生物形成区域的复杂性，对印度梨形孢在寄主植物的定殖策略及作用机制的认识还非常有限，使得印度梨形孢的应用受到限制。为此本文聚焦印度梨形孢定殖策略及作用机制，总结了其国内外最新研究进展，并对未来发展方向进行了展望，旨在系统认识印度梨形孢作用效果及促生机制，并从中寻找新的突破点，以期为进一步充分发挥印度梨形孢在农业、林业、花卉园艺业中的应用潜力提供依据。

1 印度梨形孢的特点

1.1 印度梨形孢形态特点

在PDA培养基中培养印度梨形孢（图1），观察到菌落形态紧密，布满皱纹。菌丝呈白色，高度交织，通常粘附在一起，形成简单的线状结构。定殖植物根系内部后，形成梨形厚垣孢子（图2），单独或成簇出现，孢子长度约15～25 μm，宽度约10～17 μm。未成熟孢子的壁薄而透明，成熟后的孢子的壁呈两层，厚约1.5 μm，表面为光滑的淡黄色。每个孢子通常含有8～25个细胞核[1]。

图1 PDA培养基中的印度梨形孢

图2 印度梨形孢厚垣孢子

1.2 印度梨形孢功能特点

印度梨形孢与丛枝菌根真菌(AM)相似，两者均能与植物共生，产生积极的共生效应（表1）。不同的是，印度梨形孢可以在人工培养基中无菌生长，完成其生活史。对比分别使用印度梨形孢和丛枝菌根真菌的植株，和丛枝菌根真菌形成共生关系的大麦P和N含量更高[3]，但印度梨形孢定殖的微繁殖苗显示出更高的生存率[4]。将印度梨形孢和植物促生菌（假荧光单胞菌、偶氮螺旋菌）进行比较，发现它们在促进生长、增加产量、提高耐盐性和抗病性方面具有相似效果[5-7]，但印度梨形孢在微繁殖植株的促进生长和提高成活率方面的作用更为明显[8-9]。印度梨形孢作为一种多功能的内生真菌，其培养方式简单，寄主范围广阔，对寄主植物的促生和提高抗性的作用显著，这些特点使它和其他有益内生菌相比更具优势。

表1 3种内生菌对比

印度梨形孢是一种多功能的、具有广泛适用性的真菌（图3），定殖后起到生物生长调节刺激剂的作用[10]。它通过和植物建立互惠共生关系增强寄主植物的养分获取，促进寄主生长发育，提高植物生物量和可食用部分（树叶、果实、根茎）以及供观赏部分（花朵、果实、树叶）的数量和品质[11]。同时，印度梨形孢是一种生物保护剂，通过刺激上调寄主植物防御系统成分和逆境相关基因的表达，提高植物抗病性和对生物及非生物胁迫的耐受性[12]。在营养限制和受到污染的土壤中，它是一种有效的生物肥料和生物恢复剂，可以改善土壤养分状况和修复土壤健康[13]。

图3 印度梨形孢的多种功能

2 印度梨形孢定殖策略

2.1 定殖过程

印度梨形孢接触到植物根系后，首先产生2个分枝的芽管，诱导附着胞的形成。这些附着胞根系细胞表面产生侵入性的菌丝，穿透表皮和皮层细胞，完成最初的定殖过程，最终菌丝在成熟的植物细胞内产生厚垣孢子[14]。印度梨形孢的定殖和细胞的成熟度密切相关，菌丝只侵染伸长区的成熟细胞或死细胞，不会侵染植物根系的中央分生组织、中柱鞘和气生部分[15]。随着宿主细胞组织成熟，厚垣孢子定殖数量逐渐增加，达到植物根系和真菌数量的稳定水平，最终形成了根系生长和真菌增殖的平衡。在大麦幼苗中接种印度梨形孢，结果表明，印度梨形孢在成熟的根系细胞或死亡的根系细胞中定殖，但不会引起植物的胁迫[16]。在印度梨形孢的定殖过程和植物生长的任何阶段中，地上部分始终没有其菌丝存在[14]。

2.2 定殖策略

印度梨形孢能够在不同的植物中定殖，说明它已经进化出了高度有效的定殖策略。植物具有先天的免疫系统来应对外来物种的入侵，印度梨形孢通过诱导植物激素（乙烯(ET)、赤霉素(GA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)等）表达量的上调或下调，以平衡天然免疫反应和根系定殖过程[17]。当植物感受到印度梨形孢接触时，根系的先天免疫系统立即被激活，随即产生一种温和的茉莉酸(JA)限制真菌在根系的快速定殖和生长，乙烯(ET)和赤霉素(GA)等激素纷纷响应，表现出激素水平的上调，以防真菌过度定殖，导致真菌和植物的共生关系破裂，植物生长受到负面影响。当植物根系生长和印度梨形孢定殖数量达到平衡时，植物防御反应下调，植物激素回归正常水平。相应的，不同植物物种建立了不同的机制来应对印度梨形孢的定殖，根系定殖策略和植物激素水平变化是高度特异性的[17]。

研究表明，在拟南芥和大麦中，乙烯是印度梨形孢与两种植物根系共生的必不可少的因素，乙烯信号的强弱影响印度梨形孢在植物根部的定殖情况，乙烯信号通路受损导致拟南芥和大麦根中定殖的印度梨形孢数量减少[18]。印度梨形孢定殖拟南芥时，拟南芥根系中赤霉素含量上升，促进真菌在根系的定殖。而在赤霉素(GA)合成和感知能力受损的大麦植株中，表现出防御基因的表达上升，印度梨形孢定殖数量减少[19]。

2.3 影响定殖的其他因素

印度梨形孢的成功定殖受到多种因素的共同影响。在真菌定殖根系的最初时期，根系中钙离子(Ca2+)显著增加，这可能是印度梨形孢定殖的早期信号[11]。At5g16590是一种富含亮氨酸的非典型受体蛋白，是真菌定殖的初始感知和识别的重要因子，为响应印度梨形孢的定殖，其信息在拟南芥根部中短暂上调，这种蛋白的突变体则无法识别印度梨形孢[20]。外部生长素IAA可以积极影响印度梨形孢定殖。适量施用IAA的植株表现出更好的被印度梨形孢定殖，高IAA含量则抑制了印度梨形孢的生长[21]。在最新的报道中，纤维糖作为一种新的化学介质，在真菌和寄主植物的通信中发挥重要作用[14]。

3 印度梨形孢促进寄主植物生长发育的应用效应

3.1 促进寄主植物生长

印度梨形孢对寄主植物的生长发育具有显著的促进作用，这种促生作用贯穿了植物生长的整个周期。在种子阶段，印度梨形孢促进寄主植物种子提前发芽；在幼苗阶段，增加幼苗活力提高生存率；在营养生长阶段，增加植物株高、茎粗、根系发育、枝条分蘖和分枝；在开花阶段，印度梨形孢增加花朵、花序的数量；在成熟阶段，增加种子的数量和重量，提高可食用部分（谷物、果实、树叶）的蛋白质、矿物质、次生代谢物含量和籽油品质。

研究表明，印度梨形孢的定殖能够加快植物幼苗时期的生长速度，缩短营养生长时段的时长，使植物更早转入生殖生长阶段[22]。吴金丹等[23]将印度梨形孢和水稻共同培养，发现与对照相比，印度梨形孢定殖的水稻抽穗期提前4-6天。印度梨形孢对植物生长的促进作用可通过增加鲜重或干重来衡量。印度梨形孢与番茄互作，促进了番茄的生长，番茄果实的鲜重增加了100%，干重增加20%[2]。

印度梨形孢对植物的促生作用还表现在促进地下部愈伤组织分化[24]和插条快速生根中[25]。DRUEGE等[25]将印度梨形孢应用在三种植物的扦插实验中发现，接种印度梨形孢能明显加快天竺葵和一品红扦插不定根的形成，真菌定殖的天竺葵和一品红不定根数量和长度均高于对照。但对牵牛花根系的促生作用则不明显，这可能是由于牵牛花根系发育迅速的原因。所以将印度梨形孢应用于植物快速生根的实践中，需要真菌在最短时间内定殖并产生促生效应。

3.2 提高产量，改善品质

在产品质量方面，印度梨形孢定殖的植株各种化合物浓度都有所增加，如提高龙须草的抗菌能力、积雪草中的积雪草苷含量、小茴香和百里香中的精油含量和黑胡椒中的胡椒碱的含量[22,26]。在芹菜、四九黄菜心、马铃薯、莴苣等农作物中接种印度梨形孢（表2），不仅促生作用明显，并且显著提高了这些作物的产量和品质[27-30]。印度梨形孢定殖提高作物产量，使花序和花的数量增加，获得更大的种子和果实的数量和重量，但这取决于一个具体的收获期。在番茄的早期的收获期，印度梨形孢定殖的番茄植株是对照的2倍，但下一个收获期，对照和处理的收获量差异并不显著[2]。像番茄这样收获期较长的植物，总体产量并没有很大差异。

表2 印度梨形孢对植物生长和品质的影响

3.3 促进花朵发育

植物的开花受环境因素和内部调控因素的共同作用。在开花期间，印度梨形孢对植株分蘖数、花朵数量、花序、花大小和花期等形状均有正向的影响（表3）。将印度梨形孢施用在非洲万寿菊上，发现其改善了非洲万寿菊的开花和生理性状。与对照相比，真菌定殖的万寿菊叶绿素含量更高、花径更长、花朵数量和总体的鲜花产量均有增加[32]。吕祥涛等[33]将印度梨形孢与杂交兰共同培养，发现与对照相比，印度梨形孢定殖的植株鲜重、地下部根长、地上部总长度和叶片表面积均有增加。刘慧春等[34]将印度梨形孢接种在文心兰组培苗上，观测到孢子定殖在文心兰根部表皮层，通过表皮细胞的扩增使根部加粗，株高相比于对照增加了70%，鲜重增加了96%。DAS等[35]将印度梨形孢与毛喉鞘蕊花共同培养的实验发现，被定殖的毛喉鞘蕊花开花更早，生物量更高。定殖植株比对照植株平均至少提前7天开花，180天后81%的定殖植株开花，而非定殖植株开花率仅有31%。此外，定殖植株的花序数量和长度显著高于非定殖植株。

表3 印度梨形孢对植物开花的影响

4 印度梨形孢作用机制

4.1 促进生长机制

印度梨形孢成功定殖后，以直接和间接两种方式改善寄主植物的生长、产量和品质（图4）[11]。一是直接机制，印度梨形孢通过分泌物溶解和运输养分，促进营养吸收，并吸收土壤中的重金属，改变植物和土壤的生物化学状态。真菌通过直接向根系运输营养物质和将不可用的资源转化称为植物可用的化合物这两种方式向植物提供营养，促进植物对矿质养分的吸收[36]。例如，印度梨形孢定殖后，产生大量的酸性磷酸酶，将土壤中固定的有机磷溶解为速效磷，为缺少磷素的植物提供间接的磷素来源。在其他的研究中，印度梨形孢定殖也能减轻Fe、Cu短缺对甘蔗造成的损害；在小扁豆和鹰嘴豆的实验中，印度梨形孢定殖显著提高了两种植物果实中N、P、K的浓度[14]。

图4 印度梨形孢作用机制

二是间接机制，印度梨形孢接触植物根系后，植物自身的防御系统立即被触发，以茉莉酸(JA)、赤霉素(GA)、乙烯(ET)为代表的激素水平表达上调，应对真菌定殖。当真菌和根系共生关系成功建立后，一部分激素，如乙烯回归正常水平，一部分激素受到印度梨形孢诱导，如细胞分裂素(CK)、生长素(AUX、IAA)表达持续上调，促进了寄主植物的生长[37-39]。大量研究表明，印度梨形孢定殖的植株具有浓密的根表型，根系的快速发育使寄主植物从土壤中吸收更多的水和矿物质，提高叶片叶绿素含量和光合速率[40-42]。此外，印度梨形孢还通过减少抗营养成分、产生二次代谢物、生产抗氧化剂、和调节基因表达等途径间接参与寄主植物的生长发育的过程[43-46]。在这些因素的共同作用下，寄主植物生长情况和营养水平得到很大程度的改善。

4.2 促进开花机制

miRNA调控广泛的分子过程，它参与植物激素信号传导和细胞壁代谢过程[47]。YU等[48]研究表明，有印度梨形孢定殖的兰花幼苗，地上部和根部发育更旺盛，根系中miRNA靶基因上调。印度梨形孢定殖寄主植物根部后，通过调节根系中基因表达，参与根系生长素合成和信号转导的过程，这个过程伴随植物根系快速发育和吸收营养，最终达到了对植物的花朵发育和形成的促进作用。

在拟南芥中，印度梨形孢定殖18天后，开花激活因子(FT、LFY、API)表达显著增加，而开花抑制因子(FLC)的表达减少。说明印度梨形孢是开花激活因子表达的正调控因子，是开花抑制因子的负调控因子，印度梨形孢控制拟南芥开花基因的表达[49]。同时，印度梨形孢促进了赤霉素(GA)的生物合成，通过调节GA生物合成基因的表达促进拟南芥早花。印度梨形孢和拟南芥共培养13天后，和对照相比，接种印度梨形孢的拟南芥GA3表达了增加了约5倍[49]。接种了印度梨形孢的拟南芥植株表现出明显的早花类型，开花调节基因和赤霉素合成基因被激活，赤霉素含量增加，从而导致了拟南芥的早花效应。

4.3 次生代谢物

在研究印度梨形孢对植物生长发育的作用的试验中，通常将印度梨形孢菌块投入PDB液体培养基中（200 g马铃薯；20 g葡萄糖）震荡培养10天，获得印度梨形孢培养液，用此与植物共生，产生促生效应。但在最近的研究中，发现印度梨形孢培养过滤液对植株生长的也有明显的促进作用。在曲霉菌肉汤中培养印度梨形孢15天后，用4层无菌棉布过滤出真菌，将培养过滤液用于马铃薯中，发现根数、根长、株高、叶数和植株生物量均有提高[50]。印度梨形孢培养滤液也促进了黄花蒿、亚麻和向日葵的生长，提高了向日葵整体生长量和种子产量[50-51]。这一发现为未来印度梨形孢走出实验室，作为生物菌肥进行量产，并投入农、林、花卉市场作的具体实践提供了另一条可实现的途径。

5 展望

综合前文所述，印度梨形孢被认为是植物生长促进剂、生物肥料、生物除草剂、免疫调节剂和植物土壤修复剂，在生产实践中使用印度梨形孢，可以减少化肥农药的施用，对土壤和生态环境友好，在未来发展中具有很大的潜力。然而，尽管现阶段学者们阐明了印度梨形孢与植物相互作用中的一些拼图，但由于植物生长环境的复杂性，很多作用机制仍有待探明，如PGPR产生的各种化合物及其在植物-微生物之间充当的角色；印度梨形孢与根际其他土著微生物定殖的策略差异性；以及野外应用的实际效率等。作为一种正在研究开发的新型内生菌，未来研究及应用的的主要方向包括：

（1）定殖策略研究方面：印度梨形孢能够和12个科的植物建立共生关系，与其他科植物的定殖研究仍需要深入探讨，扩大印度梨形孢的应用范围；此外，土著微生物组具有优良的适应性和稳定性，在农业应用中具有无限前景。印度梨形孢的存活和维持等功能是发挥应用效果的关键。综合宿主和印度梨形孢的生态学、生理学、遗传学和基因组学的框架，研究印度梨形孢的定殖策略尤为重要。

（2）印度梨形孢-植物互作机制方面：印度梨形孢促进植物生长发育的作用机制尚未完全明确，仍需要进一步的研究。比如利用基因工程法、理-化-生耦合技术、组学方法等综合研究微生物-植物相互作用机制，发掘、证明微生物-植物相互作用的分子机理，为微生物的应用提供基础支撑。这些先进技术，包括宏基因组、宏转录组、宏代谢组等技术在细菌机制研究中逐渐得到重视，然而在印度梨形孢-植物互作机制方面仍然需要加强。

（3）印度梨形孢相关产品的开发应用方面：菌体的保存和复苏往往限制着印度梨形孢的应用，未来需要不断开发新技术，提高印度梨形孢保质期和存活期。其次，印度梨形孢在田间试验使用时往往不能重现预设效果，这通常是由于室内和室外环境的差异导致目标微生物的野外生存能力不足。为了克服这一点，将印度梨形孢和亚硫酸盐镁混合，制成“Rootonic”配方，提升了植物产品的数量和质量。类似产品的大规模生产应用及商业化仍在进行中。在未来的农业实践中使用印度梨形孢作为生物菌剂改善土壤质量和促进植物生长发育，还应关注真菌在环境中的存活的持久性、菌剂配方和稳定性和产业化的制造加工等问题。最后，一些PGPR虽然对植物表现出良好的促进作用，但对人体健康会产生潜在安全威胁，这也是PGPR在应用中需要考虑的问题。