慢性炎症伤口的蚕丝基敷料研究进展

李萌萌, 王自立, 高玉洁, 吴金丹

(浙江理工大学 先进纺织材料与制备技术教育部重点实验室,杭州 310018)

皮肤是保护身体免受外部伤害的第一道屏障,具有分泌、吸收、感觉和调节体温等功能[1]。皮肤一旦受损形成伤口,则会导致其失去部分功能。采用适当的敷料对伤口进行管理,避免感染或炎症发生,促进伤口愈合和皮肤修复,具有重要的意义[2]。与传统医用纱布或绷带相比,近年来开发的新型伤口敷料,如纳米纤维敷料[3]、泡沫敷料[4]、水凝胶敷料[5]等,因具有丰富的功能而受到广泛的关注。

根据基体材料的来源,敷料可分为天然高分子基敷料和合成高分子基敷料[6]。其中,天然高分子基敷料普遍具有生物相容、可生物降解、与细胞亲和力高等优点;而且,其所含有的活性因子或基团,有利于细胞生长和伤口愈合,因此备受研究者青睐[7]。目前,常见的用于制备天然高分子基敷料的原料包括胶原、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和蚕丝蛋白等[8]。

蚕丝是一种天然蛋白质纤维,主要由70%～80%的丝素和20%～30%的丝胶组成,且外层的丝胶包裹着芯层的丝素[9-11]。丝素通常由蚕丝脱胶得到,具有优异的力学性能、较低的免疫原性、良好的抗炎作用及透气性,能够促进细胞的黏附、增殖、迁移和分化[12-14]。丝胶在丝绸工业中通常被当作副产物丢弃[15-16],且在早期人们对丝胶的诱导炎症作用、致敏性和免疫原性等也存在担忧[17-19],使其在生物医学应用方面的研究进展缓慢。但近年来,越来越多的研究证明了丝胶的安全性,并揭示了其具有天然的抗氧化、抗炎、抗凝、抗菌、抑制细胞凋亡、促进细胞分化等生物活性[20]。此外,由于蚕丝蛋白的氨基酸序列上具有多种活性侧基,如氨基、羟基、羧基和巯基等[21-22],因而蚕丝基敷料不仅易于被修饰和改性,还可通过多种作用力负载活性因子、抗菌剂、抗炎药等组分,从而提高敷料的功能性。

目前,大量的文献关注新型敷料的抗菌[23]、促修复[24]功能。对于慢性难愈合伤口而言,长期的炎症问题更为棘手[25]。因此,具有抗炎功能的敷料亦应受到关注。本文聚焦于蚕丝蛋白的抗炎特性,简要介绍了其抗炎机制,综述了纳米纤维、水凝胶等多类抗炎蚕丝基伤口敷料的构建方法及其在伤口修复领域的应用现状,并分析了该研究领域面临的挑战和未来的发展方向。

1 蚕丝蛋白抗炎机制

一般来说,皮肤伤口的修复过程包括四个连续的阶段:止血期、炎症期、增殖期和重塑期[26]。其中,炎症期在损伤后数小时内启动。在该阶段,中性粒细胞首先被募集到损伤区,产生大量的活性氧和蛋白酶用于杀伤病原微生物。随后,巨噬细胞(M1型)及淋巴细胞迁移到损伤区,对细胞碎片、病原微生物等进行清除[27]。由此可见,适度的炎症反应有利于皮肤伤口抵御感染,进而促进其愈合。然而,过度的中性粒细胞浸润和长期存在的M1型巨噬细胞会延长炎症期,加重组织损伤,导致伤口无法向抗炎状态发展,阻碍增殖期启动,最终影响伤口的愈合[28]。据报道,蚕丝蛋白可以抑制与炎症反应相关的促炎细胞因子的产生[29-34]。ARAMWIT等[29]研究发现,丝胶可以明显减轻大鼠水肿模型的足部炎症,其作用接近于抗炎药吲哚美辛。逆转录聚合酶链反应结果显示,在丝胶处理后,环氧化酶-2(COX-2)与诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达下调,且下调幅度依赖于丝胶浓度[29]。其中,COX-2是一种诱导型环氧化酶,其在细胞中的表达可通过炎症刺激上调,进一步促进花生四烯酸生成前列腺素,从而提高促炎细胞因子的释放,加重炎症反应和组织损伤。iNOS仅在炎症、外伤等病理条件下被诱导产生,促进合成大量的一氧化氮(NO),从而产生细胞毒性作用,加剧炎症反应。由此可见,丝胶的抗炎特性可能与抑制COX-2及NO的产生相关。同样地,KIM等[30]也发现,丝素蛋白在小鼠水肿模型中也表现出一定的抗炎活性,其抗炎能力与亲免素衍生物PEP-1-FK506BP相当[31]。这可能与丝素蛋白可下调炎症组织中COX-2、白介素(IL)-6、IL-1β及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达有关[32]。而当丝素蛋白与PEP-1-FK506BP联用时可协同作用[33],其抗炎能力较单一组分更优。此外,核转录因子-κB(NF-κB)的过度激活也可能引起趋化因子、基质金属蛋白酶、COX-2、iNOS的过度表达,从而使炎症反应进一步加重[34]。根据SONG等[35]的研究结果,丝胶可以通过抑制NF-κB通路中几种重要组分的磷酸化作用,从而抑制NF-κB通路及下调相关炎症因子(如TNF-α、IL-18、趋化因子CCL2等)的表达。

2 具有抗炎功能的蚕丝基伤口敷料

利用丝素蛋白或丝胶蛋白可制备多种形式的伤口敷料,包括纳米纤维[36]、水凝胶[37]、泡沫[38]、软膏[39]及膜[40]等。由于蚕丝蛋白具有抗炎性质,因此蚕丝基敷料也表现出一定的抗炎能力[37]。如CHOUHAN等[41]发现,原位形成的丝素水凝胶敷料可以显著下调促炎细胞因子TNF-α的表达,却使抗炎标志物CD163表达增加,表明这种蚕丝基敷料可有效发挥蚕丝蛋白的抗炎作用,在一定程度上可达到治疗伤口炎症的目的。

单一的蚕丝基敷料并不能获得较好的伤口炎症治疗效果[37,41]。因此,人们以蚕丝基敷料为载体,进一步将其他抗炎物质(如药物[42]、生物提取物[37]、抗氧剂[43]等)与其复合,以期获得优异的抗炎性能,如表1所示。

表1 各类抗炎蚕丝基伤口敷料的组成及功能Tab.1 Compositions and functions of different categories of anti-inflammatory silk-based wound dressings

2.1 蚕丝基纳米纤维敷料

近年来,纳米纤维因具有较大的比表面积、较高的孔隙率、优异的透气性等优点而在伤口修复领域引起广泛的关注[25,56-57]。目前,抗炎蚕丝基纳米纤维伤口敷料大多以丝素蛋白为基质,利用静电纺丝技术制备得到。例如,氟比洛芬作为一种非甾体抗炎药,可以有效降低COX-2的活性,降低机体炎症水平。因此,WEN等[42]通过同轴静电纺丝技术制备了一种核壳纳米纤维。这种纳米纤维的壳层为聚氧乙烯,而芯层由丝素和胶原蛋白混合而成。为了满足抗炎药更快地释放,选择性地将氟比洛芬负载于亲水的聚氧乙烯壳层;而通过将抗菌剂万古霉素包埋于纳米纤维的芯层,从而实现其缓慢释放。这种双功能纳米纤维膜在发挥抗炎作用的基础上,还具有抗菌功能,能有效避免因细菌感染而导致的炎症加重,可以满足伤口愈合的特定需求。然而,一般来说,非甾体类抗炎药往往会导致脱靶;且高剂量的药物也可能会造成严重的副作用[58]。因此,选用安全性更高的合成抗炎药替代物添加到伤口敷料中,可在一定程度上解决副作用问题。

从动植物中获得的生物提取物,如精油、酶、蜂蜜等,具有安全、便宜、环保等优点。此外,这些生物提取物通常具有固有的抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化特性[59]。因此,将这些生物提取物添加到蚕丝基伤口敷料中将赋予敷料更加优异的抗炎和促进伤口愈合功能。例如,青蒿素是一种从青蒿中提取的倍半萜内酯化合物,对活化的致病性T细胞具有选择性,可作用于级联反应中的多个免疫检查点,对多种疾病具有协同治疗作用[60]。因此,PENG等[36]采用静电纺丝法制备了负载青蒿素的聚乳酸-羟基乙酸/丝素纳米纤维膜(PLGA-SF-ART2)。由于丝素的存在,青蒿素表现出良好的缓释效果,三周后的释放量达到69%。大鼠体内实验表明,PLGA/SF/ART2纳米纤维膜可显著下调促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达,缩短全层伤口模型的炎症周期,促进皮肤再生。蜂蜜作为一种古老的、具有药理作用的营养物质,被广泛作为伤口敷料添加剂。YANG等[48]以水作为溶剂,利用静电纺丝方法开发了绿色环保、抗菌抗炎的麦卢卡蜂蜜/丝素/聚氧乙烯复合纳米纤维膜。伤口修复实验结果表明,丝素对于伤口的愈合具有一定的促进作用;而随着麦卢卡蜂蜜的引入,复合纳米纤维膜的促伤口愈合效果更加显著,与商用的爱康肤银敷料作用效果相当。

此外,当伤口处于持续的炎症反应中时,中性粒细胞会产生大量的活性氧,从而对组织造成严重的氧化损伤。因此,利用抗氧化剂去除损伤部位过量的活性氧以减小其副作用,有利于减轻损伤部位的炎症反应和促进伤口的愈合[61]。胡芦巴是豆科植物中最古老的药用植物之一,其种子具有潜在的抗氧化性质,可减小双氧水对红细胞的氧化损伤[62]。此外,其提取物也可用于增强生物材料的抗氧化性能,从而进一步加速伤口的愈合。基于此,SELVARAJ等[43]采用静电纺丝方法制备了含有胡芦巴提取物的丝素蛋白纳米纤维(图1(a)),并采用自由基捕获剂2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)研究了纳米纤维的抗氧化性能。结果表明,丝素纳米纤维的清除比例为5.6%,而含葫芦巴提取物(50%)的丝素纳米纤维的清除比例达到49.3%。由此可见,丝素自身具有一定的抗氧化能力,而葫芦巴的引入则使纳米纤维的抗氧化能力大幅提高。伤口修复实验结果表明,在第16天,未做处理和仅用丝素纳米纤维处理的伤口愈合比例分别为87.0%和93.7%,而用含葫芦巴提取物的丝素纳米纤维处理的伤口已完全闭合(图1(b)),并且显示出最为有序的胶原沉积。尽管含生物提取物的抗炎蚕丝基纳米纤维伤口敷料已被广泛报道,且在促进伤口愈合方面显示出巨大的潜力,但仍存在一些问题,如提取工艺复杂、生物活性不稳定及重复性较差等。

2.2 蚕丝基水凝胶敷料

水凝胶是一类具有三维网络结构的含水聚合物材料,表现出与细胞外基质相似的特性。水凝胶可以为伤口提供湿润的愈合环境,还具有透气、吸收组织渗出物、自溶清创等优点[2]。目前,丝素蛋白已被广泛用于制备抗炎蚕丝基水凝胶敷料。例如,YIN等[49]通过化学交联的方式将具有抗菌、抗炎功能的大黄酸引入丝素蛋白水凝胶内,从而得到丝素/大黄酸复合水凝胶。这种复合水凝胶可以提高大黄酸的稳定性和结构完整性,因而在伤口修复实验中,可更加显著地降低伤口炎症反应及预防细菌感染,并有效地重建新生血管和表皮。利用类似的方法,ZHANG等[12]将甘草酸引入到丝素蛋白水凝胶中。其中,甘草酸是一种从甘草根中提取的天然三萜,具有抗病毒、抗炎等药理作用。此外,进一步通过引入银以赋予水凝胶一定的抗菌性能。从组织切片中可以发现,用丝素/银/甘草酸处理过的伤口只表现出轻微的炎性细胞浸润现象,且在损伤发生后的第8天就已构建了较为完整的表皮和真皮。姜黄素是从姜黄中提取的一种生物分子,具有较强的抗炎和抗氧化能力,可用于预防癌症和促进伤口愈合。为此,YU等[50]利用丝素、丙烯酰-β-环糊精及丙烯酸羟乙酯制备了一种基于主-客体作用和疏水β折叠双重交联的可注射水凝胶。利用β-环糊精的包合作用,可将姜黄素负载其中;且姜黄素初期不易爆释,表现出长期、持续的药物释放行为。组织切片免疫荧光染色显示,相比于商用的3M敷料,丝素蛋白水凝胶可明显降低伤口组织处TNF-α的表达;而引入姜黄素后,这种作用更加显著。此外,金属基质蛋白酶的过量表达也会加重炎症反应和组织损伤。因此,将可与锌离子螯合的L-肌肽与姜黄素联用,一方面可以利用姜黄素直接抑制炎症反应发生;另一方面,L-肌肽可以夺取金属基质蛋白酶活性中心的锌离子,从而抑制金属基质蛋白酶的生物活性,进一步减轻炎症反应[51]。

图1 丝素蛋白-葫芦巴纳米纤维的制备示意及不同时间点的伤口照片Fig.1 Schematic diagram for preparing of silk fibroin-fenugreek nanofibers and the photographs of wounds at different time points

除丝素蛋白以外,丝胶蛋白也可用于制备蚕丝基水凝胶敷料,如单一的丝胶组分[53]、丝胶/聚丙烯酰胺[63]、丝胶/聚谷氨酸[64]等。BAPTISTA-SILVA等[53]利用辣根过氧化物酶引发交联,制备了一种丝胶基水凝胶敷料。这种水凝胶具有良好的透明性、吸水性、组织适应性及抗氧化性,可以显著下调促炎细胞因子IL-6的表达,减少炎性细胞浸润,并表现出促进细胞增殖和组织再生的能力(图2)。

图2 3M透明敷料(Tegaderm)或丝胶水凝胶处理的伤口照片Fig.2 Photographs of wounds treated with Tegaderm or sericin hydrogel

2.3 其他类型蚕丝基敷料

除了研究最多的纳米纤维类和水凝胶类,抗炎蚕丝基伤口敷料还包括膜类[40]、泡沫类[38]及软膏类[39]等。其中,膜类蚕丝基敷料可以通过浇筑法制备,一般具有较好的透明性,但透气性相对较差。如BAI等[40]通过浇筑丝素蛋白和聚乙烯醇制备了一种透明复合膜,通过添加氯化钠模板的方式,可以有效调控复合膜的孔隙率和透气性。研究发现,这种复合膜具有一定的抗菌和抗炎功能;当添加适量茶树油后,复合膜可以更加显著地抑制脂多糖诱导的巨噬细胞产生NO,且抗菌比例明显提高。WANG等[54]通过相同的方法制备了丝素蛋白膜,并基于丝素蛋白氨基酸序列上的多种活性基团与多巴胺的相互作用,获得了多巴胺-丝素蛋白膜。实验结果表明,相比于医用纱布和丝素蛋白膜,多巴胺-丝素蛋白膜处理的伤口处表现出更加轻微的炎性细胞浸润现象,且更早形成上皮组织。

泡沫类蚕丝基敷料一般可以通过冷冻干燥的方式制备,其优点在于具有多孔结构,因而可以吸收大量的组织渗出物及透气性较好;此外,还能阻碍微生物的入侵。将脱胶后的丝素溶液与一定量的天麻萃取物、乙醇混合冷冻后,进行冻干,即可制备得到孔隙率约为40%～80%的丝素基泡沫敷料。这种泡沫敷料表现出天麻和丝素的联合抗炎功能,其促进糖尿病伤口愈合的能力与商用的新霉素软膏相当[38]。

软膏是一类常见的用于促进伤口愈合的敷料形式,通常由基础组分和功能组分组成。例如,NAGAI等[39]以卡波姆934为基础组分,以曲尼斯特和丝素为功能组分制备了一种复合软膏。其中,曲尼斯特是一种治疗过敏性鼻炎、特应性皮炎、支气管哮喘的有效药物。实验结果表明,含有曲尼斯特和丝素双功能组分的复合软膏可以提高糖尿病小鼠皮肤伤口的愈合率,并减少红肿发生。ARAMWIT等[55]将丝胶与白凡士林、矿物油、羊毛脂、甘油、红没药醇、尼泊金丙酯和尼泊金甲酯混合配制了丝胶软膏,并发现该软膏处理的伤口比分别经基础软膏和生理盐水处理的伤口愈合更快,表明丝胶软膏对于伤口的愈合是有利的。此外,从组织切片结果发现,丝胶软膏处理的伤口组织中促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达较其他实验组明显下降。

3 蚕丝基皮肤组织工程支架

尽管上述新型蚕丝基敷料在促进伤口修复方面表现出了巨大的潜力,但慢性伤口的有效愈合仍是医疗系统的一个重要挑战[65]。因此,开发新的治疗策略实现更高效地促进伤口愈合和提高患者的生活质量至关重要。在过去的十年中,基于组织工程和干细胞的研究为管理慢性伤口提供了新的方法[66]。WU等[67]通过两步法制备了一种负载脂肪干细胞的丝素/壳聚糖复合皮肤组织工程支架(ADSC-SF/CS)。在第7天,相比于未做处理和经丝素/壳聚糖敷料处理的糖尿病大鼠伤口,用ADSC-SF/CS处理的伤口收缩幅度明显更大,且炎症反应较小、渗出液较少。而且从组织切片中可以看到(图3),ADSC-SF/CS处理的伤口组织有较为粗大、成熟的毛细血管(箭头所指),表明伤口愈合过程顺利进行。

图3 糖尿病大鼠的伤口及组织切片照片Fig.3 Photographs of the wounds and tissue sections of diabetic rats

羊膜是一种天然敷料,具有良好的弹性、抗菌性、抗炎性和较低的免疫原性,已在修复大面积皮肤溃疡中显示出良好的效果[68-69]。FARD等[70]、ARASTEH等[71]利用静电纺丝技术,在羊膜基底侧构建一层丝素纳米纤维,并接种月经血源性间充质干细胞(MenSCs),得到新型的皮肤组织工程支架材料。这种支架可模拟体内皮肤天然细胞外基质的微观结构,并促进MenSCs分化为角化细胞。通过实时荧光定量聚合酶链反应和免疫染色技术可以判断,新分化的MenSCs角化细胞在mRNA和蛋白水平上成功表达了角化细胞特异性标记物;而且,与传统的二维培养系统相比,在皮肤组织工程支架上分化的细胞表达了更高水平的角化细胞特异性标记物。然而,从长远角度考虑,这种支架材料仍存在一些问题。例如,同种异体移植的MenSCs的长期安全性和持续治疗效果仍未可知;供体的差异可能影响MenSCs的免疫反应和分化能力。另外,羊膜作为这类皮肤组织工程支架的重要组成部分,其来源与处理方式可能对于最终的治疗效果也会产生显著的影响。

4 结 语

得益于蚕丝蛋白来源广泛、安全、生物活性高等优点,抗炎蚕丝基敷料已在伤口修复领域显示出巨大的潜力。相比于抗炎药物和大部分生物提取物,蚕丝蛋白除了具有一定的抗炎功能外,还具有促进细胞黏附、增殖、迁移和分化的功能。此外,作为一种天然的大分子,蚕丝蛋白可制备成多种形式(如纳米纤维、水凝胶、泡沫等)的敷料,这种敷料可作为载体负载抗炎物质,能有效地下调伤口组织处促炎细胞因子的表达,缓解炎症反应,促进伤口愈合。此外,接种干细胞的蚕丝基皮肤组织工程支架利用干细胞强大的自我更新能力和分化能力,为创伤治疗开辟了全新的研究方向。

在肯定抗炎症蚕丝基敷料应用价值的同时,现存的问题及未来的发展方向也值得认真考虑。1) 伤口愈合是一个复杂的动态过程,除炎症外,包括细菌感染、渗液等问题也会对其产生明显的影响。因此,将抗菌、管理渗液等功能添加到抗炎症蚕丝基敷料中,将使其更加符合实际的应用需求。2) 适当的炎症促进伤口愈合,但过度的炎症却抑制其愈合。因此,赋予抗炎症蚕丝基敷料一定的传感功能,使其主动、自发地反馈实时的炎症情况,使患者及医护人员可以及时应对也非常必要。3) 由于蚕丝蛋白具有多种活性侧基,因此与负载物有较强的相互作用,导致药物的释放缓慢持久。然而,根据炎症的轻重程度,人们渴望药物能够表现出智能的释放行为,以达到及时治疗的目的。因此,通过合理的设计,将刺激响应性组分引入到抗炎症蚕丝基敷料中,也将是其未来研究方向之一。

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