桑蚕丝素蛋白快速检测试纸的制备及应用

闫 琳, 潘楠楠, 郑海玲, 周 旸, 王 秉

(1.浙江理工大学 材料科学与工程学院,杭州 310018; 2.中国丝绸博物馆,杭州 310002)

丝织品作为中国古代重要的纺织品之一[1],常被用作墓主人的佩剑、酒器、棺椁的包裹物,或者在千年前作为祭祀用品焚烧埋藏[2-3]。有的考古现场发掘出来的丝织物可以凭借肉眼直接分辨,但是绝大多数挖掘现场条件复杂、环境恶劣,许多纺织品都会发生物理、化学降解,成为碎片甚至是微痕迹[4-5]。

丝织品文物检测的常规方法主要有扫描电子显微镜、傅里叶转换红外光谱、拉曼光谱等[6]。扫描电子显微镜法可以通过观察样品的横纵向结构分析判断品种,但是这对文物的完整性有一定的要求,杂质和老化程度都会影响结果的判断,尤其是出土文物大部分降解损坏严重,就更难以辨别[7]。红外光谱法通过特征峰的形状、位置、强度来分析蛋白的组成,可是出土的文物无法避免不带有杂质,会对检测产生干扰,而且文物的降解也会导致特征峰偏移消失[8]。近年来,许多从事文物检测的研究者逐渐认识到免疫学检测技术的优越性,并将该技术应用到文物鉴定领域中。刘苗苗等[9]制备了特异性丝素蛋白多克隆抗体,通过酶联免疫吸附法成功鉴定出丝绸文物,为古代丝织品的鉴定提供了一种新的思路。

为了解决当前现场快速检测的问题,本文在胶体金免疫层析技术的基础上开发制备了丝素蛋白免疫层析试纸(图1),用于考古现场快速检测。该技术是免疫胶体金技术与层析法(以膜为固相载体的检测方式)相结合的新一代检测方法[10-11],近年来广泛应用于重金属离子、病毒蛋白、农药残留物等检测[12-17]。若待测样本中存在丝素蛋白,丝素蛋白抗原首先与单克隆抗体胶体金结合物反应,通过毛细管现象在膜上移动,与T线上的抗原形成竞争,因此不固定在C膜上,只与C线的二抗结合显示红色条带。通过抗原抗体特异性结合及标记物的显色,短时间即可在试纸上凭肉眼可见结果,有利于考古专家快速定性样品,极大地缩小取样范围,从而减少对考古现场的破坏,为现场检测提供了巨大的便利。

图1 胶体金免疫层析试纸及检测原理示意Fig.1 Schematic diagram and detection principle of colloidal gold immunochromatographic assay strip

1 试 验

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试 剂

人血清蛋白(HSA)、羊毛角蛋白(Wool keratin)、牛血清蛋白(BSA)、牛胶原蛋白(Bovine collagen)(杭州华安生物技术有限公司),磷酸氢二钠(Na2HPO4)、氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、碳酸钠(Na2CO3)、碳酸钾(K2CO3)、柠檬酸三纳(Na3C6H5O7·2H2O)均为分析纯AR(杭州高晶精细化工有限公司),四硼酸钠十水合物(Na2B4O7·10H2O)、硼酸(H3BO3)均为分析纯AR(麦克林生化科技有限公司),样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC底板、羊抗鼠IgG(上海杰一生物技术有限公司),新疆营盘、南海一号、新疆阿勒泰三道海子、新疆小河墓地等遗址古代纺织文物(中国丝绸博物馆)。

1.1.2 设备与仪器

85-2型恒温磁力搅拌机(常州普天仪器制造有限公司),DNP-9022型恒温培养箱(上海精宏实验设备),BSA224S型电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司),MILLI-Q®IQ7003/7005型纯水仪(美国密理博有限公司),KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),QL-861型旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司),DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验仪器设备有限公司),2015ZSIR0055ZF低温高速离心机(杭州普天生物技术有限公司),台式喷金划膜机、中速切割机(杭州格伦坤科技有限公司),金标检测仪(上海杰一生物技术有限公司),Malvern Zetasizer Nano ZS90纳米粒度电位仪(英国马尔文帕纳科有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 单克隆抗体的制备

将1 mg丝素蛋白粉末溶解在1 mL生理盐水中,与1 mL弗式完全佐剂乳化完全。初次免疫时在小鼠皮下和腹腔多处注射100 μL上述抗原乳液。然后用弗式不完全佐剂代替弗式完全佐剂,分别在第二周、第四周、第六周对小鼠进行加强免疫。最后一次加强免疫之后,采用间接ELISA法评价血清抗体效价是否合格。效价合格后,小鼠被安乐死,切除脾脏,将脾脏作为与骨髓瘤细胞融合的细胞来源。如果不合格,则继续加强免疫,直到获得合格的血清抗体效价。

细胞融合前7 d,骨髓瘤细胞在8-氮杂鸟嘌呤中培养,以确保其对IMDM选择培养基的敏感性。将脾脏放置在包含IMDM培养基的玻璃盘中,小心挤出脾脏细胞。将生长情况良好的骨髓瘤细胞按照1︰10的比例与已预热的含有脾脏细胞的IMDM培养基混合,沿管底缓慢加入1 mL聚乙二醇(PEG)1500,以1 200 r/min的速度离心5 min,弃上清。将融合后的杂交瘤细胞悬液按每孔100 μL的量包被到孔板上培养7 d,然后用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,收集以后采用免疫亲和层析柱进行纯化,获得的单克隆抗体在-20 ℃的条件下保存备用[18]。

1.2.2 胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。首先用王水浸泡250 mL的锥形瓶24 h,洗净后用双蒸水煮沸锥形瓶,重复操作5次后备用。将100 mL氯金酸(0.1 g/L)加入到预处理过的锥形瓶,然后加热搅拌至沸腾,接着迅速加入10 g/L的柠檬酸三钠,氯金酸溶液由淡黄色转变成酒红色,溶液不再发生颜色变化后停止加热。继续搅拌5 min,将冷却的溶液放置在4 ℃的条件下保存备用。

1.2.3 胶体金与抗体的偶联

取5 mL胶体金溶液,用1 mol/L的碳酸钾溶液调节其pH值,在涡旋仪上将溶液混匀,加入5 μL丝素蛋白单克隆抗体,将混合后的溶液置于37 ℃条件下搅拌孵育1 h,然后加入20 μL牛血清蛋白溶液作为封闭剂,继续搅拌孵育30 min。将得到的溶液以12 000 r/min转速离心30 min,弃上清液,4 ℃条件下保存备用。

1.2.4 胶体金试纸的制备

试纸由五部分组成:样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC底板。先对样品垫和金标垫进行预处理,将其完全浸没于处理液片刻后取出,平铺在托盘上放入37 ℃烘箱进行烘干。然后使用喷金划膜机将胶体金标记抗体喷涂在金标垫上,喷涂量为4 μL/cm,再放入37 ℃烘箱干燥备用。将丝素蛋白抗原、羊抗鼠IgG用缓冲液稀释,再用喷金划膜机在硝酸纤维素膜上划线包被,划线量为1 mg/mL,形成间隔5 mm的检测线(T线)和质控线(C线),同样放入37 ℃烘箱干燥备用。最后将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在PVC底板上,用切条机处理成4 mm宽的试纸保存备用。

1.2.5 胶体金试纸的性能表征和示范应用

为了测试胶体金试纸的灵敏度,取丝素蛋白溶于BB缓冲溶液中,配制成一系列不同质量浓度的丝素蛋白溶液(10.00、5.00、1.00、0.50、0.25、0.10 μg/mL)。将100 μL丝素蛋白溶液逐滴加入检测试纸的样品垫处,10 min后观察并使用金标检测仪进行检测,测试次数为3次,然后记录试验结果。

为了测定试纸的特异性,选取人血清白蛋白(HSA)、羊毛角蛋白(Wool keratin)、牛血清白蛋白(BSA)、牛胶原蛋白(Bovine collagen)、丝胶蛋白(Sericin)作为干扰蛋白进行测试,空白对照选用pH 8.2的BB缓冲液。将上述蛋白溶于BB缓冲液中,配制成质量浓度为1 mg/mL的测试溶液。将100 μL干扰蛋白溶液逐滴加入试纸的样品垫处,10 min后观察并使用金标检测仪进行检测,测试次数为3次,然后记录试验结果。

考虑到纺织品文物的稀缺性,称取1～3 mg的糟朽文物样品,加入BB缓冲溶剂中,37 ℃水浴下加热10 min,得到质量浓度为1 mg/mL的测试溶液,静置后取上清液100 μL,加入试纸的样品垫处,10 min后观察并记录试验结果。

2 结果与分析

2.1 胶体金与丝素蛋白单克隆抗体的最佳标记量选择

将胶体金分装成每管1 mL,分别取0、5、10、15、20、25 μg单克隆抗体加入离心管中,震荡混匀(表1)。5 min后,在上述各管中加入100 μL 10% NaCl溶液,混匀后室温静置1 h,观察结果。如果加入抗体的量不足以稳定胶体金,则离心管中呈现由红变蓝的聚沉现象;加入的抗体达到或超过最低稳定量,离心管则保持红色不变。稳定胶体金溶液红色不变的最低抗体用量即为最佳标记量。从图2可看出,胶体金溶液中的抗体质量浓度达到3#试样质量浓度时胶体金溶液便保持稳定的红色不再改变,所以确定胶体金与丝素蛋白单克隆抗体的最佳标记量为10 μg/mL。

表1 胶体金与丝素蛋白单克隆抗体的最佳标记量选择Tab.1 Selection of the optimal labeling amount of colloidal gold and silk fibroin monoclonal antibody

图2 胶体金与丝素蛋白单克隆抗体最佳标记量的优化结果Fig.2 Optimization results of the optimal labeling amount of colloidal gold and silk fibroin monoclonal antibody

2.2 胶体金与丝素蛋白单克隆抗体的标记粒径选择

胶体金的粒径选择对于胶体金试纸的灵敏度是极为重要的,不同粒径的颗粒对标记的丝素蛋白单克隆抗体的灵敏度有显著的影响。本实验选择了三种不同粒径的胶体金进行优化,分别是15、30、45 nm,丝素蛋白溶液质量浓度50、10、5、1 μg/mL，尺寸分布如图3所示。另由图4优化结果可知,使用45 nm及30 nm粒径的胶体金标记抗体后得到的试纸,在样品中丝素蛋白质量浓度低于50 μg/mL时难以进行检测,使用15 nm粒径的胶体金制成的试纸,在样品质量浓度为50 μg/mL时仍具备检测能力,直到低至10 μg/mL时才检测不到。结果说明,选择15 nm粒径的胶体金与抗体进行结合后制成的试纸在检测时更灵敏。

图3 胶体金的尺寸分布Fig.3 Size distribution of colloidal gold

图4 胶体金与丝素蛋白单克隆抗体的标记粒径优化结果Fig.4 Optimization results of labeling particle size of colloidal gold and silk fibroin monoclonal antibody

2.3 试纸的缓冲体系选择

缓冲液对于胶体金试纸的灵敏度也是极为重要的,不同pH值的缓冲体系对胶体金标记抗体的灵敏度也有显著的影响。在胶体金与丝素蛋白单克隆抗体的最佳标记量及粒径的前提下,选择适合维持抗体活性的缓冲体系进行优化,两种缓冲体系分别为PBS缓冲液、BB缓冲液,每种缓冲体系选取了三种pH值,依次为7.2、8.2、9.0,结果如图5所示。由图5可以看到,pH 8.2的BB缓冲液在阴性检测线强度相同时灵敏度更高,检测线显示颜色更清晰,且背景板残留未结合的标记物少。因此,选择pH 8.2的BB缓冲液作为该试纸的缓冲体系。

图5 试纸的缓冲体系优化结果Fig.5 Optimization results of buffer system for the assay strip

2.4 灵敏度检测结果分析

在优化条件下,对丝素蛋白进行定量检测,检测结果如图6所示。从图6(a)可以看出,随着样品中丝素蛋白质量浓度的增加,试纸检测线(T线)的颜色会随之变浅。当样品中的丝素蛋白质量浓度为0.5 μg/mL时,可以看出T线与检测pH 8.2的BB缓冲液的试纸有明显差异;当样品中的丝素蛋白浓度达到1.0 μg/mL时,T线彻底消失。因此,可以得出样品质量浓度为0.5 μg/mL以上时,可用肉眼观测检测结果。由图6(b)可知,随着样品中丝素蛋白的质量浓度增大,T线上的金标含量逐渐减少,继而T/C的金标量比值逐渐减小,曲线呈现负增长的趋势,符合试纸的检测原理。

图6 试纸的灵敏度检测结果Fig.6 Sensitivity of the assay strip

2.5 特异性检测结果分析

通过图7(a)可以看到,空白对照(BB缓冲液)和人血清白蛋白(HSA)、羊毛角蛋白(Wool keratin)、牛血清白蛋白(BSA)、牛胶原蛋白(Bovine collagen)、丝胶蛋白(Sericin)等干扰蛋白样品的检测结果均为阴性,T、C线均显色,而丝素蛋白样品在试纸检测结果中T线不显色,呈现阳性检测结果。由图7(b)可知,金标仪检测得出的T/C值柱状图也表明了该试纸具有良好的特异性。

图7 试纸的特异性检测结果Fig.7 Test results regarding the specificity of the assay strip

2.6 文物样检测结果分析

为了确定试纸对实际考古样品的检测能力,本文选取新疆营盘、南海一号、新疆阿勒泰三道海子、新疆小河墓地等遗址的古代文物样进行检测,样品如图8(a～d)所示,其中图8(a～c)为丝织物样品,图8(d)为新疆小河墓地的毛织物样品。新疆营盘处于楼兰和尉犁之间,是丝路中道的主要城市,由于当地地区常年干燥,留存了许多古代丝织物;“南海一号”是南宋初期一艘在海上丝绸之路向外运送货物时失事沉没的木质古沉船,它为复原海上丝绸之路的历史、陶瓷史提供极为难得的实物资料;三道海子在历史上是通欧亚“草原丝绸之路”上的要冲,通过这条通道,商旅们源源不断地把中原的丝绸、茶叶等货物运往中亚及欧洲各地,又把欧洲和沿途各地的货物、物产带到中原地区。通过对图8(a～c)样品的检测,结果中T线不显色,只有C线显色(图8(e～g)),表明上述文物样品中均含有丝素蛋白,而图8(d)毛织物样品的检测结果为阴性(图8(h)),T、C均显色,说明该样品不含丝素蛋白。这些检测结果说明,该试纸可以为考古遗址的丝织品检测提供新的检测方法。

图8 考古样品的图像及试纸检测结果Fig.8 Images and assay strip test results of archeological samples

3 结 论

本文为检测考古现场丝织品微痕迹,开发了一种胶体金标记丝素蛋白单克隆抗体的免疫层析试纸。通过抗原抗体特异性结合,专一灵敏地检测样品中存在的丝织品痕迹。质量浓度为0.5 μg/mL以上时,可用肉眼观测,5～10 min内即可获得检测结果,且具有极好的特异性,能实现专一微量的丝素蛋白检测。在对实际古代文物样进行检测后也展现了优秀的定性检测结果,可为之后的考古现场检测提供了可靠便捷的实用工具。

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