霉变棉衣物上微生物的鉴定与抑制

肖雨嫣，任泽华，杨 宇，高 源，刘建立

(1.江南大学纺织科学与工程学院，江苏无锡 214122；2.无锡小天鹅电器有限公司，江苏无锡 214028)

衣物在储存或穿着过程中因微生物污染造成“发霉”现象，在衣物上形成霉斑，造成衣物异味，影响衣物的外观和寿命。穿着发霉衣物容易造成皮肤交叉感染，存在健康风险[1]。人体分泌的代谢物如皮脂，汗液等吸附到衣物上给微生物提供营养使在其上繁殖生长[2-3]。因此，衣物在日常生活的环境中很容易被微生物污染，在潮湿的阴雨环境中霉菌更易滋生。衣物上的霉菌与日常生活中霉菌真菌种类息息相关。已有学者围绕纺织品致霉微生物提取和鉴定开展了研究工作。李世超等[4]对丝绸上霉菌进行研究，最终确定了引起丝绸纹样霉变的微生物菌属为根霉属、拟青霉属和黑曲霉属等。刘俊等[5]对皮革上的霉菌进行分离鉴定，研究结果表明皮革制品的优势霉菌主要为曲霉属和青霉属。不同织物上霉菌的种类存在差异，因此需要鉴定衣物的霉菌微生物种类，针对衣物上霉菌的优势菌种，采用有效的抑菌剂，保护纺织品，延长其使用寿命。

目前，纺织品微生物的研究主要集中在抗菌面料领域，但属于霉菌抗菌研究还相对较少。常用的化学抗菌剂的应用研究在主要集中在山梨酸盐、丙酸钙盐及磷酸盐等方面[6]。其中苯甲酸钠和山梨酸钾因价格低廉，又具有广谱的抑菌效果，被广泛使用在抗菌领域中。López等[7]制备的山梨酸钾抗菌膜材对乳酪上常见的青霉菌、沙门氏菌有一定的抑制效果。Fasihnia等[8]研究发现聚丙烯中添加少量的山梨酸钾制备的包装膜，对黑曲霉有一定的抑制效果。此外，邢海丽等[9]研究发现苯甲酸钠对白色葡萄球菌有较好的抑制效果。Sun等[10]研究发现了金属锌化物对细菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、假单胞菌等都具有良好抗菌活性。

本文从霉变衣物上提取霉菌，在PDA培养基采取适宜的温度和湿度进行培养分离和纯化。将得到的纯化的单一菌株进行形态学观察和ITS序列分析，确定了衣物上霉菌的种类。并将优势菌种接种到棉织物上，为了模拟霉菌在棉衣物上真实生长情况，将人体皮脂作为微生物营养物质。采用山梨酸钾、硫酸锌和苯甲酸钠作为抗菌剂，探究3种抑制剂的抑菌效果以及最佳添加量。为阐明棉衣物霉变机理提供实验参考，为开发有效的纺织品防霉技术奠定基础。

1 实 验

1.1 实验材料与设备

1.1.1 实验材料

霉变衣物：视觉可见霉斑的5件全棉衣物，来源地为河南省。

织物：全棉14.5 tex平纹漂白机织物。经向密度：524根/10 cm，纬向密度：283根/10 cm，平方米质量：120 g/m2。

药品：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(上海化学试剂有限公司)；PBS缓冲液(上海泰坦科技股份有限公司)；角鲨烯(化学纯，阿拉丁试剂有限公司)；吐温80、三油酸甘油酯、油酸(化学纯，上海化学试剂有限公司)；乳酸石炭酸棉蓝(福州飞净生物科技有限公司)。

1.1.2 实验设备

LHS-80HC-II型恒温恒湿箱(上海珂淮仪器有限公司)、YXQ-LS-75G型立式压力蒸汽灭菌锅(上海双旭电子有限公司)、VHX-5000超景深三维数码显微镜(基恩士公司)、P-BO型轧压机(无锡铭翔机械设备有限公司)、J-2型菌落计数器(无锡杰瑞安仪器设备有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 衣物上霉菌的分离纯化

参照国家标准GB 4789.15—2016《霉菌和酵母计数》中的方法，裁剪10 g的霉变棉衣物，随后加入90 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，摇床设置28 ℃、180 r/ min震荡12 h后取出。提取菌液，逐次稀释10倍。将稀释后的菌液滴1 mL在培养基中，随后密封放置在恒温培养箱中，设置28 ℃，95%温湿度培养。观察霉菌生长情况，将得到的菌落按照不同的形态、颜色进行筛选。之后，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养基中纯化，放置恒温恒湿箱中培养。重复3次，得到纯化好的单一菌落。

1.2.2 菌落形态观察

将得到的形态单一的菌落采用接种针取菌丝，点在PDA培养基中，放置恒温恒湿箱中倒置培养，根据菌落的形态特征，通过《中国真菌汇总》[11]进行霉菌形态学的鉴定。

1.2.3 菌体形态观察

观察纯化后的霉菌个体形态，通过透明胶带镜检法[12]，在载玻片上滴乳酸石炭酸棉兰染液，使用透明胶带轻轻粘取菌落，盖于玻片上。将载玻片置于超景深显微镜载物台上，选择筒形透视光源，超景深倍镜放大1000倍，观察霉菌菌丝的形态和孢子形状。

1.2.4 ITS扩增及测序

基于ITS序列对分离菌株进行分子鉴定。通用引物ITSl(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4(5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′)进行扩增。PCR选取50 μL反应体系：10×buffer 5 μL；模板引物1 μL；引物各2 μL ；dNTP 4 μL；MgCl24 μL；Tag酶1μL；加入50 μL双蒸水。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s；72 ℃延伸50 s；循环30次；72 ℃保温5 min[13]。扩增完成后，采用1%的琼脂糖进行电泳，送往天霖生物科技有限公司进行测定。

1.2.5 序列分析

在NCBI数据库输入得到的序列结果，采用BLAST同源性进行比较分析，根据比对的结果获取对应霉菌菌株的种属信息。使用MEGA7.0软件选择Neighbor-Joining邻接法，检验1000次，绘制系统进化树[13]。

1.2.6 皮脂污染试样制备

皮脂污染液制备：根据人体皮脂含量，制备质量分数为4%混合皮脂污染液，称取角鲨烯、油酸、三油酸甘油酯和1%吐温80乳化剂加入搅拌杯中，再加入适量的去离子水至200 mL，放置高速搅拌机转速18 000 r /min，搅拌 5 min，得到稳定的皮脂组分乳化液[14-15]，其配方如表1所示。

表1 混合皮脂污染液配比

皮脂污染试样制备将棉织物原样裁剪成 8 cm×8 cm(10 g)的正方形，浸入上述质量分数为4%的皮脂组分乳液中，用玻璃棒轻压使试样浸润在溶液中，15 min后取出，在轧车上浸轧。浸轧后，织物平铺晾干，紫外线杀菌之后密封保存备用。

1.2.7 霉菌污染试样制备

孢子悬浮液制备在纯化好的霉菌培养基中加入10 mL的无菌水，用接种环轻刮培养基，随后倒入含有玻璃珠的锥形瓶中，手摇震荡以分散成团孢子液使孢子液充分混匀。将孢子液倒入离心管前使用滤纸进行过滤，以除去菌丝等杂物。设置高速离心机4500 r/min离心，10 min后取出。随后去除上层的清液，再加入15 mL无菌水，重复上述步骤3次。获得的孢子液即为实验用的孢子液[16]。孢子液以 1 mL 的用量滴加在1.2.6制备的皮脂污染试样上以作霉菌污染试样。

1.2.8 抑菌液的制备

分别选择山梨酸钾、硫酸锌和苯甲酸钠作为抑菌剂，每种抑菌剂分别称量0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g加入100 mL的去离子水中配置成不同浓度的抑菌液。

1.2.9 棉织物上菌落个数的测定

将培养好的棉织物取出，采用霉菌计数器记录不同浓度的抑制剂处理下棉织物上霉菌的总数。探究不同抑制剂对棉衣物上霉菌的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 霉菌的形态学分析

对从霉变棉衣物上提取的霉菌进行分离纯化，纯化后观察菌落形态和菌落颜色等，并且使用超景深显微镜观察霉菌的分生孢子和顶囊等形状情况[13]，初步鉴定得到7种霉菌，编号依次为A、B、C、D、E、F和G。采用相机拍摄7种霉菌，菌落图片如图1所示。衣物上霉菌的个体形态如图2所示。表2 为衣物上霉菌的形态的描述。通过霉菌形态和资料查询，初步鉴定结果为菌种A为根霉属、B和E为青霉属、C和F为曲霉属、D为枝孢属以及G为茎点霉属。由形态学的鉴定结果可得到青霉属和曲霉属菌种占比较多，属棉衣物上的优势菌属。

图1 衣物霉菌菌株培养后菌落形态

图2 衣物霉菌菌落培养后菌体形态

表2 衣物霉菌菌落形态和菌体形态描述

2.2 ITS序列分析鉴定

将得到的7种霉菌进行ITS序列扩增，扩增产物进行测序，在NCBI数据库将得到的序列结果进行BLAST对比分析。检索分离出的菌株和数据库的菌株同源性达到99%以上，可视为同一种[11]。微生物的 ITS序列分析如表3所示，进化树如图3所示。因此，A、B、C、D、E、F、G分别为匍枝根霉、顶青霉、黄曲霉、芽枝状枝孢霉、桔青霉、杂色曲霉和茎点霉菌。从提取的7种霉菌的ITS序列测序结果中选取与对应菌株同源性较高的序列构发育树[16]。由图3可知，7种霉菌的ITS序列分为4个分支，青霉属和曲霉属是同种属的进化关系且为霉变棉衣物上的优势菌属。

图3 衣物上霉菌微生物的ITS系统进化树

表3 衣物上霉菌的ITS序列分析鉴定结果

2.3 不同抑菌剂对单菌落的影响

对霉变棉衣物上分离出的优势菌属：黄曲霉、顶青霉、桔青霉和杂色曲霉进行抑菌实验，探究3种抑制剂对单一霉菌的抑制效果，将制备好的单一霉菌菌液滴在裁剪好的棉织物上，然后放置恒温恒湿箱中14天后取出，采用菌落计数器记录棉织物上霉菌菌落个数，探究抑制剂抑菌情况。图4、图5、图6和图7分别为3种不同浓度抑菌剂对棉织物上黄曲霉、顶青霉、桔青霉以及杂色曲霉的霉菌个数的抑制情况。

由图4可知，棉织物上黄曲霉总菌落个数随着3种抑菌剂浓度的增加而减少。硫酸锌的抑制效果较其他两种抑制剂效果好，当棉织物上硫酸锌质量浓度为1.40 g/mL时，织物上黄曲霉菌落个数为0，此时硫酸锌抑菌效果良好；棉织物上苯甲酸钠质量浓度为1.60 g/mL时，织物上霉菌菌落个数为0，此浓度下的苯甲酸钠可以有效抑制黄曲霉在棉织物上的生长；棉织物上山梨酸钾的质量浓度为1.60 g/mL时，织物上霉菌菌落个数为6，织物上还存在少量黄曲霉菌落。当山梨酸钾的质量浓度为1.80 g/mL时，织物上无霉菌生长，此浓度下的山梨酸钾具有较好得到抑制效果。

图4 抑菌剂质量浓度对棉织物上黄曲霉菌落个数的影响

由图5可知，硫酸锌的抑制效果较其他两种抑制剂效果好。当棉织物上硫酸锌质量浓度为1.40 g/mL时，织物上顶青霉菌落个数为0，此浓度下的硫酸锌对顶青霉有良好的抑制效果；棉织物上山梨酸钾质量浓度为1.60 g/mL时，织物上霉菌菌落个数为0，此时苯甲酸钠抑菌效果良好；棉织物上苯甲酸钠的质量浓度为1.60 g/mL时，织物上霉菌菌落个数为35，织物上边缘生长少量顶青霉菌落。当苯甲酸钠的质量浓度为1.80 g/mL时，织物上视觉不可见霉菌生长，用菌落计数器放大观察，发现边缘地区个别菌落，此浓度下的苯甲酸钠对棉织物上的顶青霉有好的抑制效果。

图5 抑菌剂质量浓度对棉织物上顶青霉菌落个数的影响

由图6可知，硫酸锌和山梨酸钾的抑制效果较苯甲酸钠的抑制效果好。当棉织物上硫酸锌和山梨酸钾的质量浓度为1.40 g/mL时，织物上桔青霉菌落个数为0，此浓度下两种抑菌剂抑菌效果良好；棉织物上苯甲酸钠质量浓度为1.60 g/mL时，织物上几乎无霉菌生长，边缘部分有2个桔青霉菌落，此浓度下的苯甲酸钠对棉织物上桔青霉的抑菌效果较好。

图6 抑菌剂质量浓度对棉织物上桔青霉菌落个数的影响

由图7可知，硫酸锌的抑制效果较其他两种抑制效果好。当棉织物上硫酸锌的质量浓度为1.20 g/mL时，织物上杂色曲霉菌落个数为0，此浓度下的硫酸锌对棉织物上杂色曲霉的抑菌效果良好；当山梨酸钾的质量浓度为1.40 g/mL时，织物上杂色曲霉菌落个数为0，此时抑制效果良好；当棉织物上苯甲酸钠质量浓度为1.40 g/mL时，采用菌落计数器发现织物上霉菌个数为3，但视觉不可见霉菌生长，此浓度下的抑菌效果良好。

图7 抑菌剂质量浓度对棉织物上杂色曲霉菌落个数的影响

2.4 不同抑制剂对衣物优势菌落的影响

将从霉变棉衣物分离出的优势菌属，顶青霉、黄曲霉、桔青霉和杂色曲霉制成混合菌液，采用移液枪取1 mL菌液滴于裁剪好的1 0g的棉织物上，待完全吸收后，再加入1 mL配置好的不同浓度的3种抑菌液。最后将制备好的试样放入28 ℃，95% RH的恒温恒湿箱中培养14 d取出。由图8、图9和 图10 抑菌剂对棉织物霉菌的抑菌效果图可知，将混合菌液接种在棉织物上，14 d之后棉织物上生长大量霉菌，覆盖棉织物表面。随着3种抑菌剂添加量增多，棉织物上霉菌总数不断减少。

图8 山梨酸钾抑菌效果

图9 硫酸锌抑菌效果

图10 苯甲酸钠抑菌效果

在实验中，当在织物表面滴加的山梨酸钾质量浓度为0.10 g/100 mL时，棉织物上霉菌面积较少，但边缘地区还有少量生长。山梨酸钾质量浓度达到0.12 g/100 mL时，棉织物无霉菌生长，此时山梨酸钾抑菌效果较好。当硫酸锌质量浓度达到0.10 g/100 mL时，棉织物上还有较多霉菌生长，质量浓度达0.12 g/100 mL 时，棉织物上无霉菌生长，此浓度下硫酸锌对棉织物上优势霉菌有良好的抑菌效果。当织物表明滴加苯甲酸钠质量浓度达到0.12 g/100 mL时，棉织物上还有少量霉菌生长，质量浓度达0.14 g/100 mL时，棉织物上无霉菌生长，此浓度下的苯甲酸钠能有效抑菌。

3 结 论

本实验采用PDA培养基分离纯化河南地区5件霉变棉衣物上的霉菌微生物，通过形态学初步鉴定出7种的霉变微生物，通过ITS序列分析和同源性比较，鉴定出这7种霉变微生物分别为匍枝根霉、顶青霉、黄曲霉、芽枝状枝孢霉、桔青霉、杂色曲霉和茎点霉菌。其中曲霉属和青霉属占比约60%，为棉衣物上致霉的优势霉菌菌属。将棉衣物上单一的优势霉菌菌属分别接种到棉织物上，采用山梨酸钾、硫酸锌和苯甲酸钠作为抑菌剂，当棉织物上硫酸锌质量浓度为1.40 g/mL，苯甲酸钠质量浓度为1.60 g/mL，山梨酸钾的质量浓度为1.80 g/mL时，对棉织物上黄曲霉和顶青霉有良好的抑菌效果；硫酸锌和山梨酸钾的质量浓度为1.40 g/mL，苯甲酸钠质量浓度为1.60 g/mL时，对织物上桔青霉的抑菌效果良好；硫酸锌的质量浓度为1.20 g/mL，山梨酸钾和苯甲酸钠的质量浓度为1.40 g/mL时，能有效抑制棉织物上杂色曲霉的生长。

为了模拟真实衣物上霉菌的抑制效果，将优势霉菌制成混合菌液接种到棉织物上，实验表明，当山梨酸钾和硫酸锌添加量为0.12 g/100mL时，苯甲酸钠添加量为0.14 g/100mL时对棉织物优势霉菌的抑菌效果良好。