不同叶位芽叶在工夫红茶加工过程中理化品质的变化

周静芸，黄 瑞，欧阳珂，陆安霞，陈林木，童华荣,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.宜宾学院农林与食品工程学部，四川 宜宾 644000）

茶是世界上最受欢迎的饮料之一，而红茶则因其独特的风味和健康作用成为风靡全球的茶类，占全球茶叶消费量78%左右[1]。按照加工工艺的不同，红茶可以分为小种红茶、工夫红茶和红碎茶。在中国，工夫红茶更受消费者喜爱[2]。在红茶加工过程中，茶鲜叶经过萎凋、揉捻（切）、发酵和干燥几个工序，内含成分发生剧烈变化[3]，形成了红茶典型的红汤、红叶及甜醇的滋味特征[4-5]。萎凋会提高多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力[6]，增加细胞膜的渗透性[7]，揉捻会破坏叶片叶肉细胞，导致液泡细胞液释放[8]，使得位于细胞液泡中的儿茶素[9]与叶绿体类囊上的PPO结合[10]，发生酶促氧化反应，形成茶黄素和茶红素等影响红茶干茶的色泽、茶汤颜色和滋味品质的化学组分[11-12]。在加工过程中叶绿素会降解[13]，但不同成熟度叶片的叶绿素含量不同，叶绿素含量随着成熟度增加而增加[14]，这可能对工夫红茶叶底品质有影响[15]。同时，不同成熟度新梢（或叶片）的儿茶素、没食子酸（gallic acid，GA）等也有很大差异[16]，其对揉捻的响应也不同，从而影响发酵[17]。Selvendran[18]和Harris[19]等观察了红茶加工过程中叶片结构的变化，但没有结合加工过程中品质组分的变化进行研究。本研究通过对工夫红茶加工过程中不同叶位叶片的微观结构及不同叶位芽叶的品质组分的变化分析，考察各部分在加工过程中理化品质的动态变化及其品质响应，以期为优质工夫红茶在原料的选择、加工工艺及品质评价等方面提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

福鼎大白茶（Camellia sinensis(L.) O.Kuntze cv.Fuding Dabaicha）茶树品种，一芽二叶鲜叶，2021年4月采摘于重庆市大足区。

番红固绿（植物）染液、电子显微镜固定液 武汉赛维尔生物科技有限公司；叶黄素（纯度≥98%）、叶绿素b（纯度≥90%） 上海源叶生物科技有限公司；叶绿素a（纯度≥85%） 上海麦克林生化科技有限公司；脱镁叶绿素a（纯度≥95%）、8 种儿茶素组分及GA均为标准品（纯度≥98%） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；甲醇、乙腈、无水吡啶、冰乙酸、丙酮（均为色谱纯）、醋酸双氧铀、柠檬酸铅、乙醇、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、福林-酚、碳酸钠、乙酸乙酯、正丁醇、草酸钠、氢氧化钠（均为分析纯） 成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

RM2016病理切片机、UC7超薄切片机 德国徕卡仪器有限公司；Ultra45°钻石切片刀 深圳市泽任科技有限公司；HT7800/HT7700透射电子显微镜日立（中国）有限公司；Eclipsee 100正置光学显微镜 尼康映像仪器销售（中国）有限公司；UltiMate3000高效液相色谱仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；Synergy H1酶标仪 安捷伦科技（中国）有限公司；5810R冷冻离心机 德国艾本德公司；MDF-86V340E(D)超低温冰箱 安徽中科都菱商用电器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工夫红茶加工工艺及样本制备

原料按照传统工夫红茶工序加工，具体操作如下：将鲜叶置于晾青架上萎凋至含水量60%～62%（室温20 ℃、相对湿度68%～70%）→揉捻90 min（不加压45 min-轻压20 min-中压20 min-不加压5 min）→发酵3 h（发酵箱内温度30 ℃、相对湿度92%～94%）→干燥（毛火120 ℃、15 min-摊凉回水45 min-足火90 ℃至刺手）。

样本制备：对每个加工过程中的一芽二叶在制品进行手工筛选及分离，分解为芽、第一叶、第二叶、茎梗（图1）。对以上分离好的茶样及一芽二叶在制品立即液氮固样，冷冻干燥后粉碎过40 目筛密封，置于－80 ℃超低温冰箱保存备用。

图1 工夫红茶加工工艺流程及样本制备示意图Fig.1 Flow chart of Congou black tea processing and tea sample preparation

1.3.2 叶片显微结构观察

采用常规石蜡切片技术对第一叶和第二叶进行切片取样。因茶树叶片较嫩，为防止原料在固定过程中收缩、蒸发以及变硬，采用自制改良的甲醛-乙酸-乙醇固定液（formaldehyde-acetic acid-ethanol fixative，FAA）（5 mL体积分数38%甲醛溶液＋5 mL冰醋酸＋90 mL体积分数50%乙醇溶液＋5 mL甘油）固定24 h。经脱蜡、番红染色、脱色、固绿染色、中性树胶封片等一系列操作后，使用正置光学显微镜对其观察和拍照。

1.3.3 叶片超微结构观察

取第一叶和第二叶叶片主脉两侧组织约1 cm3的小组织块，放入电子显微镜固定液中，用真空泵抽气直至沉底。4 ℃下固定24 h后对样本进行漂洗后固定、渗透包埋、浸透包埋、聚合、超薄切片（60～80 mm）、醋酸双氧铀和柠檬酸铅对其双重染色后选择典型区域观察、拍照。

1.3.4 酚类化合物含量测定

茶多酚（tea polyphenols，TP）质量分数和儿茶素组分含量测定参照GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，其中TP质量分数测定采用分光光度法，表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）含量及GA含量测定采用高效液相色谱法；茶黄素、茶红素、茶褐素含量测定采用系统分析法。儿茶素类总量（total catechins，TC）、EGCG、EGC、ECG氧化率按下式计算。

式中：m1为鲜叶中酚类化合物含量/（mg/g）；m2为毛茶中酚类化合物含量/（mg/g）。

1.3.5 叶绿素组分测定

参照陈丽等[20]方法采用外标法对同一波长条件下吸收峰的面积进行定量计算。其中，叶绿素a异构体用叶绿素a标准曲线方程定量，叶绿素b异构体用叶绿素b标准曲线方程定量，其他无标准品的叶绿素组分根据脱镁叶绿素a的标准曲线方程定量，标准曲线方程如表1所示。

1.4 数据统计与分析

利用Excel 2019软件进行数据整理，采用SPSS 20.0软件进行单因素方差显著性分析（以P＜0.05定义为差异显著），利用Origin 2019b和Adobe Photoshop 2020软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同叶位芽叶的表型结构在加工过程中的动态变化

2.1.1 不同叶位芽叶在加工过程中的色泽变化

图2展示了工夫红茶在加工过程中制品的色泽变化情况。在传统工艺加工过程中，茶树鲜叶色泽由鲜绿逐渐变红最后形成乌黑油润带金毫的成品茶。揉捻叶中不同叶位芽叶的色泽由绿开始变红，发酵叶中单芽、第一叶、茎梗红变均匀，而第二叶和一芽二叶还含有一定的青叶。由此可见，不同叶位芽叶均在揉捻时色泽发生变化，且第二叶的红变程度弱于其他叶位。

图2 红茶加工流程图及叶底青张表型Fig.2 Flow chart of black tea processing and the phenotype of infused leavse with blue

2.1.2 不同叶位叶片的显微结构在加工过程中的动态变化

鲜叶中叶肉细胞的细胞核及木质化的细胞壁经番红固绿染色后呈红色，细胞质及纤维素的细胞壁呈绿色，栅栏组织、海绵组织及维管束均可明显区分，且不同叶位叶片间海绵组织细胞间隙、维管束细胞组成结构有一定的差异（图3A）。其中，第一叶的维管束细胞有序排列呈近圆形，而第二叶呈近椭圆形；海绵细胞形状多样，有3～4 层，第一叶海绵细胞排列整齐，而第二叶海绵细胞排列疏松，间隙发达。如图3B所示，萎凋叶中，叶肉细胞染红处有少量黄色出现：随着萎凋时间的增加，细胞失水，细胞质膜与细胞壁发生质壁分离，表明细胞正处于死亡的初期阶段。在这一阶段，第一叶与第二叶的显微结构较鲜叶变化显著，第一叶的维管束细胞形似椭圆，第二叶的维管束细胞排列无序且不成形，已经开始破碎；第一叶的海绵细胞排列整齐，有3～4 层，第二叶海绵细胞排列相对整齐，有3～4 层。由此可知，不同叶位叶片在维管束细胞结构及海绵细胞间隙上存在差异。揉捻叶中，栅栏组织层长柱细胞及海绵组织层薄壁细胞呈红黄杂色，其中第一叶颜色更深（图3C～D）。在机械力的作用下，叶肉细胞组织结构遭到破坏，从而发生萎缩变形、质壁分离、细胞破碎。当发酵结束时（图3E），大多数叶肉细胞已被完全破坏，其中第一叶表现得更明显，栅栏组织及维管束被彻底破坏并变形，上、下细胞排列松散、扭曲，细胞形状不规则，整体呈金黄色；第二叶栅栏组织及维管束也被破坏，较第一叶破坏程度轻，整体呈红黄色。由此可知，揉捻和发酵阶段，第一叶的细胞结构破坏程度较第二叶重，这可能是导致第一叶发酵叶的色泽较第二叶红的原因。

图3 第一、二叶的显微结构在工夫红茶加工过程中的动态变化Fig.3 Microstructure changes of the two leaves during Congou black tea processing

2.1.3 不同叶位叶片的超微结构在加工过程中的动态变化

不同叶位叶片在加工过程中的超微结构形态变化如图4、5所示。由图4可知，鲜叶和萎凋叶中不同叶位茶树叶片细胞超微结构完整且基本相同，叶绿体完整分布在细胞壁周围，液泡完整。揉捻使茶叶在外力的挤压下，叶肉细胞结构受损，叶绿体结构被破坏，液泡内液溢出充满整个细胞，细胞壁内折变形，导致叶片细胞结构发生显著变化，这种变化持续到发酵结束。由此可知，机械揉捻破坏细胞的完整性，导致液泡细胞膜丧失选择的能力，从而使液泡内多酚类物质与细胞质内源氧化酶类发生反应。

图4 第一、二叶的超微结构在工夫红茶加工过程中的动态变化Fig.4 Ultrastructure changes of the two leaves during Congou black tea processing

图5反映了叶绿体形状和结构上的变化，鲜叶中叶绿体结构完整，呈椭圆形，内外膜清晰，基粒片层排列致密且整齐，同时第二叶的叶绿体中清晰可见淀粉粒和嗜锇颗粒（图5A），研究表明嗜锇颗粒和淀粉粒的含量与叶片成熟度有关[21]。萎凋过程中叶绿体呈近圆形的形态变化（图5B），这可能与萎凋细胞失水有关。揉捻45 min时，叶绿体结构发生一定程度的破损，内外膜模糊或消失，基粒片层排列稀疏紊乱。叶绿体内膜系统被破坏，嗜锇颗粒大量产生，类胡萝卜素生成[22]，第二叶的淀粉颗粒缺失（图5C），且基粒片层排列较第一叶有序。揉捻结束时（图5D），不同叶位茶树叶片的叶绿体损伤度几乎与揉捻45 min时相近，仅第二叶的基粒片层排列较稀疏紊乱。由图5C1、D2可知，不同叶位茶树叶片的叶绿体在揉捻时变化最大，结构发生变化，基粒片层排列变稀疏紊乱，而在发酵叶中变化不大（图5E），差异不明显。

图5 第一、二叶的叶绿体在工夫红茶加工过程中的动态变化Fig.5 Morphological changes of the two leaves during Congou black tea processing

2.2 不同叶位芽叶的酚类化合物在加工过程中的含量变化

2.2.1 TP、儿茶素类、GA在加工过程中的含量变化

不同叶位芽叶的TP和儿茶素类在加工过程中呈不同幅度的下降趋势（图6），在鲜叶和萎凋叶中下降幅度较小，揉捻叶中下降幅度大，这与揉捻破坏了茶树叶片细胞结构有关。成品茶中芽、第一叶、第二叶、茎、一芽二叶的TP质量分数较鲜叶分别降低了55.45%、46.36%、53.57%、49.21%、52.52%。第一叶和第二叶TP质量分数在鲜叶、萎凋叶、发酵叶中差异不显著（P＞0.05），揉捻叶中第一叶TP质量分数较第二叶显著降低16.92%（P＜0.05）。揉捻叶中，第二叶、一芽二叶的EGC含量差异不显著（P＞0.05），而第一叶和第二叶的TC、EGCG、EGC、ECG含量均差异显著（P＜0.05），第一叶含量较第二叶分别低24.14%、53.05%、12.36%、45.17%，这是由于揉捻阶段第一叶的结构破坏程度较第二叶严重（图3），多酚类物质与酶的结合更充分，酶促氧化作用更显著。在发酵叶及成品茶中，第一叶和第二叶的EGC含量和TC含量差异不显著（P＞0.05），而EGCG含量差异显著（P＜0.05），发酵叶及成品茶中第一叶EGCG的含量较第二叶分别降低51.51%、26.01%。芽、第一叶、第二叶的EGC含量在成品茶中差异不显著（P＞0.05）。由图6F可知，不同叶位芽叶的G A 含量在加工过程中呈先增加后减少又增加的动态变化。由于酯型儿茶素降解生产GA[23]，在揉捻结束前GA含量增加，随着发酵的进行，GA氧化成邻醌参与色素的形成[24]，其含量减少。芽、茎梗在加工过程中显著低于其他叶位（P＜0.05），不同叶位叶片的GA含量在揉捻叶和成品茶中差异显著（P＜0.05），第二叶含量较第一叶分别提高26.81%、18.63%，这与儿茶素类物质在加工过程参与氧化反应有关。

图6 不同叶位芽叶茶多酚、儿茶素类、没食子酸含量在工夫红茶加工过程中的动态变化Fig.6 Changes in tea polyphenols,gallic acid,and catechin contents in the bud and the two leaves during Congou black tea processing

本研究表明，不同叶位芽叶在工夫红茶加工过程中多酚类化合物差异变化体现在在制品中，成品茶中第一叶的TP质量分数较第二叶显著高17.27%（P＜0.05），第二叶的GA和EGCG含量较第一叶分别显著提高18.63%和35.16%（P＜0.05）。

2.2.2 茶色素在加工过程中的动态变化

红茶加工过程中品质形成的关键是揉捻和发酵工序，通过揉捻，叶片组织结构和叶肉细胞被破坏，位于细胞质中的儿茶素等多酚化合物被PPO、过氧化物酶（peroxidase，POD）氧化，形成茶黄素类、茶红素类、茶褐素类等关键品质成分，从而使产品表现出红汤红叶的特征品质。其中，茶黄素类影响茶汤亮度、强度和鲜度，是形成茶汤“金圈”的主要成分，茶红素类影响茶汤的口感和茶汤颜色[25]，两者共同构成红茶滋味鲜、醇，茶汤亮，叶底红的品质特点。茶褐素类含量与红茶品质成负相关，易使红茶茶汤发暗、滋味无收敛性、叶底暗褐，对红茶品质不利。

由图7A可知，不同叶位芽叶在加工过程中茶黄素含量呈先增后减的动态变化趋势，芽、第一叶、第二叶、茎、一芽二叶在揉捻阶段茶黄素质量分数达到最大值，分别为0.74%、0.96%、0.94%、1.21%、1.02%。其中，第一叶、第二叶、一芽二叶的揉捻叶中茶黄素质量分数差异不显著（P＞0.05），较萎凋叶分别高5.13、7.06、9.94 倍。成品茶中第一叶、第二叶、一芽二叶茶黄素质量分数差异不显著（P＞0.05），较萎凋叶分别高2.99、4.04、6.10 倍。芽、第一叶、茎、一芽二叶茶红素含量在揉捻时达到最大值（图7B），分别为4.95%、6.38%、7.05%、7.14%，揉捻后质量分数趋于稳定。成品茶中第一叶与一芽二叶茶红素质量分数差异不显著（P＞0.05），但第一叶与第二叶差异显著（P＜0.05），第一叶较第二叶高27.62%，较一芽二叶高10.59%。由图7C可知，不同叶位的茶褐素含量均在揉捻阶段增加迅速，后期过程中缓慢增加，这同样与揉捻破坏细胞完整性有关。第一叶与第二叶、一芽二叶成品茶褐素质量分数差异显著（P＜0.05），其中第一叶成品茶茶褐素质量分数较第二叶高10.35%，较一芽二叶高13.32%。这是因为第一叶茶红素含量高于第二叶、一芽二叶，在酶促氧化反应中生成了更多的茶褐素。

图7 不同叶位叶片的茶黄素（A）、茶红素（B）、茶褐素（C）在工夫红茶加工过程中的动态变化Fig.7 Dynamic changes in theaflavins (A),thearubigins (B) and theabrownines (C) contents in the bud and the two leaves during Congou black tea processing

茶叶发酵指多酚类化合物被酶类物质氧化的过程，目前对红茶发酵程度的判定以时间、温度、色泽、香气、生化指标为标准[26]，本研究以酚类化合物的氧化率来判定不同叶位芽叶的发酵程度。由表2可知，第一叶和第二叶中TC、EGCG、EGC、ECG的氧化率差异不显著（P＞0.05）。Muthumani等[27]研究表明，红茶加工中儿茶素组分氧化率依次为EGC＞EGCG＞ECG，而本研究3 种儿茶素组分的氧化率比较中，不同叶位均是EGCG的氧化率最大，且第一叶和第二叶的氧化率顺序（EGCG＞ECG＞EGC）一致，Jiang Yongwen等[28]的研究也证实EGCG在发酵中消耗量最高。

表2 不同叶位叶片在工夫红茶加工过程中的氧化率比较Table 2 Comparison of oxidation degrees of the one bud and two leaves at different leaf positions during Congou black tea processing

2.3 叶绿素组分在工夫红茶加工过程中的动态变化

不同叶位芽叶的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素类总量在加工过程中均下降，且在干燥阶段呈快速下降的动态变化（图8A～C）。其中，第一叶成品茶叶绿素a、叶绿素b、总量较鲜叶分别减少了95.81%、86.69%、55.90%，第二叶成品茶叶绿素a、叶绿素b、总量较鲜叶分别减少了96.38%、91.52%、67.26%，一芽二叶成品茶叶绿素a、叶绿素b、总量较鲜叶分别减少了93.63%、80.36%、49.15%。脱镁叶绿素a、脱镁脱叶绿醇基叶绿素的含量在整个加工过程中呈上升趋势（图8D、E），揉捻结束后含量增加明显。这是由于揉捻叶中的细胞受损，pH值降低，使呈绿色的叶绿素发生脱镁反应生成黑色或褐色产物[29]。第一叶和第二叶成品茶的脱镁叶绿素a和脱镁脱叶绿醇基叶绿素分别较鲜叶高102.03%、434.34%和135.07%、372.04%，第二叶的脱镁叶绿素a和脱镁脱叶绿醇基叶绿素较第一叶分别高29.73%和44.17%。由图8F可知，在工夫红茶加工过程中，叶绿素aʹ、叶绿素bʹ、原焦脱镁叶绿酸a仅在干燥阶段检测出来，第一叶和第二叶的含量均差异显著（P＜0.05），第二叶的含量较第一叶分别高3.77%、15.47%、12.43%。当叶绿素被破坏时，工夫红茶色泽由黑色的脱镁叶绿素、墨绿色的脱镁脱叶绿醇基叶绿素、残留的绿色叶绿素影响。由图8可知，不同叶位叶片的叶绿素组分无论在整个加工过程中如何变化，第二叶含量始终显著高于第一叶（P＜0.05），即成熟度较高的第二叶比第一叶更易在色泽上呈现绿色或暗绿色。

图8 不同叶位芽叶的叶绿素组分在工夫红茶加工过程中的动态变化Fig.8 Dynamic changes in chlorophyll components of the one bud and two leaves at different leaf positions during Congou black tea processing

3 结论

本研究从加工工艺和加工原料两个方面探究工夫红茶加工过程中不同叶位叶片结构变化、不同叶位芽叶酚类化合物和叶绿素组分的含量变化及其品质响应，以期为加工优质工夫红茶在原料的选择、加工工艺方面提供一定的理论依据。并希望通过此研究结果阐明实际加工过程中以一芽二、三叶为鲜叶原料的工夫红茶出现叶底青张的原因，以期为优质红茶的加工及品质评价提供一定的指导。

工夫红茶具有“红汤红叶”的品质特征[30]，但以一芽二、三叶为原料制成的工夫红茶多存在色泽枯暗，汤色欠红，叶底青张、花杂等现象[31]。“青张”是茶叶感官审评叶底的术语，表示夹杂青色叶片。本研究表明，不同叶位芽叶在工夫红茶加工过程中色泽会逐渐由绿变红，经干燥可制成乌黑油润带金毫的成品茶，但第二叶的红变程度弱于其他部位。分析发现第一、二叶在揉捻时液泡及叶绿体均被破坏，表明不同叶位叶片的发酵是同阶段同步进行的；鲜叶中PPO和POD活力以茎梗部位含量最高，其他部位会随着叶片的成熟度而降低[32-33]。此外，茶色素的形成不仅与酶活力有关[34]，还与底物的含量有关[35]。本研究中，第二叶鲜叶的TC、EGCG、ECG含量均显著低于第二叶（P＜0.05），EC、EGC含量显著高于第一叶（P＜0.05）。第二叶的儿茶素氧化与第一叶和芽同步，且氧化率也没有显著性差异（P＞0.05），说明在加工过程中揉捻和发酵工艺对第二叶有同样的效率。

叶绿素组分分析结果显示，加工过程中不同叶位芽叶的叶绿素a、叶绿素b含量以及叶绿素类总量均下降，脱镁叶绿素、脱镁脱叶绿醇基叶绿素含量均上升，与Li Jia等[36]的研究结果一致。加工过程中第二叶的叶绿素组分含量均显著高于第一叶（P＜0.05），这使得第二叶叶底色泽较第一叶更绿。由此可以推测，叶底青张现象与叶片中脂溶性色素的叶绿素含量有关，与不同叶位叶片的发酵程度无关，即叶底青张受原料的成熟度影响。

本研究表明揉捻工艺也是影响工夫红茶色泽及品质成分的重要工序。目前的传统加工工艺对一芽二、三叶原料加工优质工夫红茶有效，该结果可为加工优质工夫红茶提高茶树鲜叶的利用率提供一定的理论依据。此外，叶绿素及其降解产物对红茶滋味、汤色、香气无重要贡献[30]。因此，对一芽二、三叶制得的工夫红茶品质评价时，建议不应对其叶底青张现象扣分。