基于铁死亡理论的骨质疏松症发病机制的探讨*

毕煦昆 赵建栋 郭成龙

1 甘肃中医药大学,甘肃省兰州市 730000; 2 甘肃中医药大学附属医院

细胞死亡曾经被分为两个类别:调节性细胞死亡和意外细胞死亡,在正常的生存条件下,调节性细胞死亡也被称为程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD),它包括凋亡、坏死、自噬等途径,并涵盖多种信号级联反应[1]。近些年来人们发现了一种新型的调节性细胞死亡方式,并命名为铁死亡(Ferroptosis) ,它是一种由铁离子介导的引起铁依赖性活性氧类(Reactive oxygen species,ROS)的累积,损耗细胞膜联蛋白,引起细胞死亡的过程。而细胞铁死亡的过程中往往伴随铁超载伴随ROS 的大量堆积,导致骨量的大量流失,骨的微观形态的改变。骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种与骨代谢平衡失衡密切相关的代谢性骨科疾患,其主要特征表现在骨量的下降、骨稳态的失衡、骨结构疏松、脆性增加等,其病因包括性别、年龄、遗传、营养状况、细胞因子及激素水平异常等[2]。 本文初步通过铁死亡理论探讨骨质疏松的发病机制,旨在为未来骨质疏松症的药物研发及诊治提供一定的思路和方法。

1 铁死亡理论摘要

1.1 铁死亡概念 铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡方式,该方式区别于细胞坏死、细胞凋亡、细胞自噬[3]。在阐明铁死亡的具体机制和相关信号通路之前,曾有部分研究者已经在实验中发现了该细胞死亡方式,但未予以重视,或将其归结于其他细胞凋亡方式。2003年,Dolma等[4]在研究杀死肿瘤细胞的药物过程中发现了可以杀死RAS致癌蛋白及 small T 转染的细胞的小分子化合物,并命名为伊拉斯汀(erastin),而erastin在整个细胞的凋亡过程中并未激活和裂解半胱氨酸蛋白酶(Caspase),也没有导致细胞核及染色质的改变,所以进一步推测可能是一种新型的细胞凋亡方式。后续有许多研究者包括Yang等[5]均在类似实验过程中发现这一小分子化合物erastin,这一化合物可以通过抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白系统(Cystine/glutamate antiporter,system Xc-)来诱导某种铁依赖型的细胞死亡,具体的机制是该系统能减少胱氨酸依赖的还原型谷胱甘肽(GSH)的合成,破坏细胞氧化还原稳态,引起大量过氧化物的累积,从而导致细胞死亡,并证明了 erastin 抑制会胱氨酸的吸收。2012年, Dixon等[6]证明,基于致癌蛋白ras选择性致死小分子erastin介导所引发了一种非细胞坏死凋亡,这种凋亡机制十分独特并且依赖于细胞内的铁,而非其他化合物,在生物化学和遗传学上与细胞凋亡、坏死和自噬不同,并在对肿瘤细胞凋亡的研究中发现了铁死亡抑制剂 (Ferrostatin-1),并将该机制命名为铁死亡。

1.2 铁死亡的基本特征 铁死亡的生物学特征是通过影响胱氨酸吸收、减少谷胱甘肽合成、产生花生四烯酸等其他分子来抑制胱氨酸谷氨酸转运受体(System XC-系统)和谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的活性从而导致脂质过氧化物的大量蓄积,诱导细胞死亡[7]。铁死亡的形态学特征:细胞铁死亡主要表现为细胞变小、变圆、细胞间分离;细胞膜的皱缩、细胞脂膜的起泡;线粒体皱缩、线粒体嵴的消退、线粒体外膜破裂及线粒体膜密度增高等[8]。铁死亡的分子生物学特征:铁死亡是一种普遍的、动态的细胞死亡形式,Gpx4有望产生实质性的细胞保护作用。GPX4酶在脂质过氧化中起到了十分重要的作用,主要体现在它可以使过氧化物的过氧化键还原为氢键,使过氧化物的活性丧失。GPX4酶的活性主要体现靶点有:System Xc-体系(负责将GSH的合成原料半胱氨酸转运至胞内的体系)、谷氨酸—半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽s-转移酶、ND脱氢酶、(半胱氨酸)消耗等[9]。

1.3 铁死亡机制

1.3.1 GSH消耗导致的GPX4失活:GPX4可以保护细胞膜免受脂质过氧化物的破坏。在 Ras 选择性致死化合物3(Ras-selective lethal compound 3,RSL3)诱导细胞铁死亡的过程中,RSL3与谷胱甘肽(Glutathione,GSH)依赖性酶—谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione per-oxidase,GPX)4的靶点相互结合,激活GPX4并催化 GSH 依赖的高反应性脂质氢过氧化物还原为非反应性脂质醇,削弱脂质过氧化的能力,保护细胞免受膜脂质过氧化作用[10]。那么由于各种理化原因导致的GSH消耗就会引起GPX4的失活,从而诱导铁死亡。

1.3.2 铁离子的摄入与还原:Ferroptosis 是铁离子诱导的细胞死亡,向细胞中输入大量的Fe2+,并且保证铁离子不被氧化,通过芬顿(Fenton)反应Fe2+可启动脂质体过氧化,有研究发现铁螯合剂DFO、CPX 等会减少铁死亡形式的发生率[11]。有关铁螯合剂的研究发现,其主要作用机制可能与含铁的酶活性有关,因为许多酶以铁离子为分子基础,如果细胞摄入的铁离子不能尽快与相关配体或者受体相结合,就会介导fenton反应生成有代谢毒性的ROS大分子化合物,攻击细胞膜,从而使得细胞破裂死亡。然而,Fe2+不仅会通过氧化还原反应引起细胞铁死亡,它还会引起其他类型的细胞死亡,如细胞凋亡、坏死、自噬等[12]。

2 铁死亡相关信号通路

2.1 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)4 信号通路 在Che-Lin Hu等[13]的研究中发现:GSH和GPx4一起有效地减少了有毒的氢过氧化物的含量,而过氧化物(ROS)的大量堆积正是引起铁死亡的原因。抗肿瘤药物 erastin 诱导细胞铁死亡与 GSH-Px4 也存在一定关系,研究表明 erastin的主要作用机制在于抑制 SystemXc-,阻碍机体 GSH 的合成,间接影响GSH-Px4的活性,导致细胞铁死亡。谷胱甘肽过氧化物酶通路进一步受到SystemXc-的调控,它是由SLC7A11和SLC3A2的异二聚体组成的氨基酸反转运蛋白,对GSH合成至关重要。可以直接使用抑制SystemXc-功能的化合物伊拉斯汀(erastin),诱导铁死亡。

2.2 p53/SAT1/ALOX15信号通路 已知调控 p53 基因可诱导内皮细胞和肿瘤细胞的ferroptosis进程,通过抑制p53基因可以使GSH和GPx4发挥生物学活性,抑制ROS的累积,从而保护细胞生存。p53调节多种细胞功能,如代谢调节、活性氧(ROS)应激反应和铁钩反应,这些新出现的功能现在被认为在p53介导的肿瘤抑制中发挥关键作用。在Jiang L等[14]的研究当中发现SAT1是p53代谢靶基因,可以被内源性和外源性p53诱导;SAT1参与调节p53介导的ROS反应和铁死亡,关于铁细胞凋亡是如何被调控的,p53的其他靶点在ROS诱导的铁细胞凋亡中起着什么样的作用,目前还不得而知。因此对于p53基因及其相关信号通路的研究有助于进一步阐明有关铁死亡的机制,有望为临床诊治骨质疏松症提供新的思路和方法。

3 骨质疏松症与骨稳态

骨骼的生长发育与新陈代谢维持在一个动态的水平中,与机械刺激以及激素波动密切相关。在生物体内骨组织通过骨髓间质细胞、骨细胞、成骨细胞之间的协同作用,共同发挥调节骨稳态的作用;骨重塑在微骨折的修复、骨的生物力学的稳定性以及抵抗机械损伤和维持骨量方面都有极其重要的意义[15]。人类骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)是具有多向分化潜能的组织干细胞,可分化为骨、脂肪、心肌等细胞,并在多种疾病的治疗中发挥作用[16]。各种理化因素的作用或者暴力的刺激,使得骨髓间质细胞向成骨细胞的转化减少,骨细胞数量下降,骨质变得疏松,骨稳态受到破坏,从而引起骨质疏松。近些年以来骨质疏松的患病率大幅增加,成为人类面临的一大疾病[17]。

4 铁死亡与骨质疏松

骨质疏松症(OP)是由于多种原因导致的以骨密度及骨强度的下降、骨微观结构的破坏、脆性增加,容易引起骨折及并发疼痛为特征的全身骨骼系统疾病[18],目前有一些研究证明,细胞内的大量Fe2+的蓄积会导致芬顿反应的发生,介导ROS的大量蓄积,使得铁依赖的细胞膜发生过氧化反应而破裂导致细胞死亡[19]。骨质疏松的机制关键在于骨稳态的失衡,OP的发病原因还与机体代谢异常、基因多态性、微循环障碍等因素密切相关。而铁死亡的特点是细胞死亡需要(脂质过氧化物)ROS积累,铁过载以及MEK活性是脂质过氧化物生成的条件。

4.1 ROS的累积 在骨质疏松症的发病过程中,涉及了成骨细胞及破骨细胞的铁死亡进程,其中包含大量脂质过氧化物(ROS)累积。ROS主要来源于线粒体,是正常细胞内线粒体通过电子转移的方式代谢产生的副产物,主要包括羟基、过氧化氢等。正常情况下,机体可以通过抗氧化酶(如 GSH、GPX)清除ROS以维持体内过氧化物的平衡,但同时Fe2+也会促使大量的ROS形成,即Fe2+通过芬顿(Fenton)反应诱导ROS 形成[20]。形成的过量ROS 会破坏细胞膜稳定性,使细胞膜破裂导致细胞死亡。

4.2 铁超载 铁离子是体内最常见的微量元素之一,对维持人体正常生理活动有着重要的意义,机体内存在着铁稳态,即铁离子不断被吸收、利用、储存、循环,并处于一个动态平衡的状态,这对于维持细胞的正常新陈代谢至关重要。铁在人体内发挥极其重要的生物学功能,是生物体必需的元素,它参与了DNA及RNA的修复、维持细胞生长和增殖、细胞分化、细胞休眠与恢复等生命代谢活动,但是铁超载也会危害人体的细胞和组织。有研究表明,铁超载可以刺激成骨细胞的自噬与凋亡,其具体机制可能与二价金属离子转运体1有关[21]。在有关铁超载抑制成骨细胞增殖的研究中发现,高铁刺激可以通过激活成骨细胞ASK1-p38信号通抑制成骨细胞的功能,诱导其铁死亡,该机制可能与ASK1抑制硫氧还蛋白的构象转变有关[22-23]。因此,适量铁的摄取可以促进细胞的增殖,但铁超载会抑制细胞的生长发育和分裂,甚至诱导细胞凋亡。

4.3 酶促脂质过氧化 铁死亡发生的另一条主要途径是酶促脂质过氧化,在这一过程中起着至关重要的作用的是脂氧合酶,它能诱导多不饱和脂肪酸脱氢生成磷脂氢过氧化物;而在 Fe2+的催化作用下,磷脂氢过氧化物会分解成烷氧基自由基 (RO-),从而攻击其他多聚不饱和脂肪酸引发脂质过氧化的连锁效应。另一方面,磷脂氢过氧化物在相关酶的催化下会分解成4-羟基壬烯醛和丙二醛,这几种小分子化合物会通过交联反应破坏膜蛋白的稳定性,增加细胞膜的通透性,诱导细胞铁死亡[24]。在Sokoya T等[25]人的研究中,发现一种鞘磷脂合酶SMS2通过破坏跨双层鞘磷脂不对称性,导致成骨细胞无法维持非随机脂质分布的能力,引发了细胞铁死亡。可见,在引发骨细胞铁凋亡的进程中,相关脂代谢的酶也起着十分重要的作用

5 问题与展望

铁死亡是近年来才发现的一种新型细胞死亡方式,目前针对铁死亡的机制尚未完全阐明,有关ROS累积导致膜蛋白转运抑制的相关信号通路还未研究明确,铁超载对于细胞的毒性以及相关酶活性的分子机制仍有待进一步研究。基于铁死亡理论探讨骨质疏松的发病机制主要集中于ROS的累积、铁离子的超载及酶促脂质过氧化反应,但具体不同细胞之间的铁代谢和信号通路之间是否存在差异仍不明确。对于相关铁死亡的基因研究,明确了部分的凋亡机制,随着科技的发展以及相关理论的不断完善,对于铁死亡机制以及相关基因靶点的发掘,会对未来骨质疏松症的诊治和抗骨质疏松症药物的研发有着更为深入的指导意义。