非生殖器皮肤疣的HPV分型与临床特征分析

戴海蓉 凌宏忠 曹光玲 欧树玉 谢继璜 周晖

中山大学附属第一医院皮肤科，广州 510080

人类乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染皮肤黏膜导致局部上皮良性增生形成疣，临床上常见有寻常疣、扁平疣、跖疣和尖锐湿疣等。迄今已发现150 余种HPV 型别，不同HPV 型别与不同病毒疣相关［1-6］。目前，国内外对于尖锐湿疣的HPV 分型研究较多［7-12］，而对于非生殖器皮肤疣（寻常疣、扁平疣和跖疣）的研究相对较少。北京市、贵州省、江苏省等小样本报道中，HPV 型别分布差异较大，提示可能存在区域性差异［13-15］。仅有一项研究分析了广东省内一家医院诊治的96 例扁平疣的HPV 基因型感染情况［16］。本研究则更进一步分析寻常疣、扁平疣和跖疣等非生殖器皮肤疣的HPV 感染的型别特点和规律，现总结报道如下。

资料与方法

1.研究对象

入组2019 年7 月至2020 年11 月在中山大学附属第一医院皮肤科就诊的116 例非生殖器皮肤疣患者开展队列研究，男63 例，女53 例，年龄（38±12.41）岁。纳入标准：⑴依据《中国临床皮肤病学》对疣的临床分类，结合病史和典型皮损作出诊断，包括发生在非生殖器部位皮肤的寻常疣、扁平疣和跖疣（足底寻常疣）［17］。⑵患者签署知情同意书。排除标准：⑴生殖器疣；⑵皮肤镜检查排除鸡眼、胼胝、疣状皮肤结核、汗管瘤、点状掌跖角化病等；⑶其他排除标准包括人类免疫缺陷病毒阳性，器官移植或骨髓移植，活动性感染（细菌、真菌、病毒、结核等），恶性肿瘤或不典型增生，明确的自身免疫性疾病，治疗前1 个月内口服免疫抑制或免疫增强药物，年龄小于16岁或大于60岁。

2.临床资料采集

采集的临床资料包括：⑴年龄、性别等基本资料；⑵病毒疣病史，起病年龄、病程等；⑶病毒疣临床表现、皮损部位、皮损形态、大小、数目等；⑷起病前皮损史、生活方式、密切接触史；⑸合并疾病和既往病史；⑹治疗史。

3.疣体组织HPV分型检测

⑴试剂与仪器：主要试剂包括基因组DNA 提取试剂盒、聚合酶链式反应（PCR）Master Mix试剂盒、通用引物、型特异性引物、标准DNA Marker和皮肤型HPV 分型检测试剂盒（PCR+导流杂交法）等（广东潮州凯普生物化学有限公司）。主要仪器包括玻璃组织研磨器、电子微量天平、微型振荡器、涡旋混合器、电热恒温水槽、深低温冰箱、台式低温离心机、稳压稳流定时电泳仪、PCR 扩增仪（Bioer Life Express PCR 仪，博日公司）和导流杂交仪（HHM-2，凯普公司）等。

⑵主要方法：征得患者同意后，采集疣体组织标本。用组织剪剪取或直接用刀片刮取适量疣体组织，加无菌生理盐水用研磨器磨成匀浆，转移至离心管中，以12 000 r∕min离心3 min，采用基因组DNA 提取试剂盒，按照说明书步骤提取制备DNA 模板，装入配置好的PCR 管内。采用通用引物MY09∕11扩增HPV 保守序列，目的片段长度450 bp，引物序列为5'-CGTCC（AC）A（AG）（AG）GGA（T）ACTGATC-3'（正向引物）和5'-GC（AC）CAGGG（AT）CATAA（CT）AATGG-3'（反向引物）；扩增程序：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，循环数40，再延伸72 ℃ 5 min。基因扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳回收阳性条带，采用型特异性引物进一步扩增目的片段；扩增程序：预变性95 ℃ 9 min，变性95 ℃ 20 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循环数40，再延伸72 ℃ 5 min，4 ℃冷却停止。采用Sanger 测序检测HPV DNA 碱基序列。最后在Genebank上做blast比对，判定HPV型别。

4.统计学分析

HPV 检出率、各部位皮肤疣的性别构成比、3 种皮肤疣（寻常疣、扁平疣和跖疣）的构成比以及HPV 型别所占比例等计数资料采用例（%）形式表示，患者年龄、皮肤疣病程、皮损数目等符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示。百分比参数比较采用卡方检验，均数比较采用独立样本t检验或单因素方差分析。统计学软件为SPSS for win 20。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

1.一般临床资料

116 例非生殖器皮肤疣患者中，男性63 例，女性53 例；年龄16～54（38.00±12.41）岁；病程2～62 个月，中位时间17 个月；皮损数目1～21（6.00±1.32）个。其中HPV 阳性105例，HPV检出率为90.50%。

2.不同部位皮肤疣的比较

105 例HPV 阳性患者的皮肤疣分别位于头面部（15 例）、躯干部（9 例）、手部及指甲周（24 例）、足部及足底（57 例）。各部位皮肤疣患者的性别、年龄、病程、疣体数目以及皮损形状等情况见表1。

手部疣患者以女性为主（16∕24，66.7%），足部疣患者以男性为主（41∕57，71.9%）。手部疣患者年龄明显低于头面部疣患者（t=2.86，P=0.006 0）和躯干部疣患者（t=2.29，P=0.027 0）；足部疣患者年龄明显低于头面部疣患者（t=3.34，P=0.002 0）和躯干部疣患者（t=2.68，P=0.010 0）。手部疣患者病程明显长于头面部疣患者（t=8.97，P＜0.000 1）和躯干部疣患者（t=6.16，P＜0.000 1）；足部疣患者病程明显长于头面部疣患者（t=8.32，P＜0.000 1）和躯干部疣患者（t=5.45，P＜0.000 1）；躯干部疣患者病程也长于头面部疣患者（t=4.19，P=0.000 2）。头面部以菜花状、丘疹状为主，躯干部以乳头状和丘疹状为主，手部多为丘疹状，足部主要为斑块状。见表1。

表1 105例HPV阳性非生殖器皮肤疣患者的临床特征

3.不同类型皮肤疣的HPV型别分析

105 例HPV 阳性患者中，跖疣、寻常疣、扁平疣分别占51.43%（54∕105）、32.40%（34∕105）和16.20%（17∕105）。基因测序检出HPV 型别包括HPV 1、HPV 2、HPV 4、HPV 5、HPV 6、HPV 18、HPV 27、HPV 41、HPV 57、HPV 58、HPV 94 等共11 种。11 种HPV 型别中，以HPV 1（53.33%）、HPV 27（37.14%）、HPV 2（29.52%）和HPV 4（23.81%）为主，其他依次为HPV 94、HPV 41、HPV 57、HPV 6、HPV 5、HPV 18 和HPV 58。3 例寻常疣中检出高危型HPV 18，1 例扁平疣中检出高危型HPV 58，其余均为低危型HPV 型别。寻常疣、扁平疣和跖疣的HPV 型别基本上均以HPV 1、HPV 2、HPV 4和HPV 27为主，其中HPV 1型最多。与寻常疣比较，跖疣组织中HPV 27明显多于HPV 2和HPV 4。见表2。

表2 105例HPV阳性非生殖器皮肤疣患者不同类型皮肤疣的HPV亚型分析

105 例阳性标本中，48 例（45.71%）为单一HPV 型别感染，57 例（54.29%）同时存在双重或多重HPV 型别感染。仅发生单一感染而未合并其他HPV 型别的是HPV 18、HPV 58 和HPV 94，其余型别均存在合并感染。合并感染中，绝大多数存在HPV 1 型，以HPV 1+HPV 4（14 例）、HPV 1+HPV 2（11 例）、HPV 1+HPV 27（10 例）为主，其次为HPV 2+HPV 27（5例）、HPV 1+HPV 4+HPV 27（5例）。见图1。

图1 105例HPV阳性非生殖器皮肤疣患者HPV亚型单一感染、双重感染和多重感染情况。A：HPV亚型单一感染；B：HPV亚型双重感染；C：HPV亚型多重感染

4.不同部位皮肤疣的HPV型别分析

头面部疣、躯干部疣、手部疣和足部疣的患者，双重∕多重HPV 感染所占比例分别为26.67%（4∕15）、33.33%（3∕9）、58.33%（14∕24）和63.16%（36∕57）。比较各组患者中双重∕多重HPV 感染所占比例，手部疣明显高于头面部疣（58.33%比26.67%，χ2=3.836，P=0.050），足部疣明显高于头面部疣（63.16%比26.67%，χ2=6.500，P=0.018）；其余两组之间比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。

表3 105例HPV阳性非生殖器皮肤疣患者不同部位皮肤疣的HPV亚型分析（例）

5、不同部位皮肤疣患者的生活方式和相关病史

头面部、躯干部、手部和足部皮肤疣患者中，许多患者有熬夜、失眠和学习工作压力大等生活方式特点；头面部疣、手部和足部皮肤疣患者多有局部皮损史、局部出汗多等诱因，手部和足部皮肤疣患者多合并手足癣和湿疹等疾病，并具有密切接触史。此外，躯干部疣多发生于四肢，尤以下肢、前臂多见；手部疣患者尤以家庭主妇长期接触水及生鱼、肉为多；足部疣多发皮损中以青壮年男性居多，且多自己进行不规范处理，皮损逐渐扩大融合。见表4。

表4 105例HPV阳性非生殖器皮肤疣患者的诱因、生活方式和相关病史（例）

讨论

目前关于非生殖器皮肤疣HPV型别的研究较少。现有研究结果提示：非生殖器皮肤疣的HPV型别与黏膜、生殖器疣的HPV 型别存在较大差异，并且不同国家和地区之间也存在比较明显的差异，明确特定地区的HPV 感染型别规律有助于更深入了解皮肤疣特点。本研究中的105 例皮肤疣患者全部来自广东地区，发现HPV 型别是以HPV 1、HPV 27、HPV 2 和HPV 4 为主，其他依次为HPV 94、HPV 41、HPV 57、HPV 6、HPV 5、HPV 18 和HPV 58，这与现有报道结果不尽相同。荷兰246例患者的744份皮肤疣标本中，最多见的HPV 型别依次为HPV 2、27、57、4、1，其他频率较低的包括HPV 3、7、10、28、65、88、95、41 等［18］。约旦200 例皮肤疣标本中，常见HPV 型别为HPV 2（36%）、HPV 27（28%）、HPV 57（21%）［19］。捷克人皮肤疣标本中HPV 6 占72%［20］。日本寻常疣主要感染型别为HPV 1、4、65［21］。我国不同地区的HPV 型别也存在较大差异：北京市48例寻常疣常见HPV 型别依次为HPV57、1、27、2［13］；江苏省48 例寻常疣则以HPV 7 为主［14］；贵州省寻常疣常见型别为HPV 2、1，扁平疣主要型别为HPV 2、10、3、1［15］。各个地区报道的HPV 感染型别有所不同，也可能跟研究者设计或使用的检测试剂对HPV 各基因型的覆盖和检测效能等不同有关。与文献报道比较，本研究HPV 1 比例明显较高，而HPV 57 比例较低。另外我们观察到，本研究中扁平疣患者的常见HPV 型别与寻常疣、跖疣患者的常见HPV 型别基本相同，以HPV 1、HPV 2、HPV 4 和HPV 27 为主，区别于以HPV 3、10、28、41 为主的报道［22］。这些研究发现提示广东地区HPV 感染的流行病学特点可能与其他地区不同，值得进一步调查研究。

皮肤疣中HPV 常以合并感染的形式存在。荷兰744 份皮肤疣标本中，单一型别感染占79%，HPV 多重感染占16%，普遍合并感染的型别是HPV63［23］。北京48 例寻常疣患者双重感染仅占8.3%，主要是HPV1 合并其他型别［13］。本研究中双重或多重HPV 型别感染的比例较高，占54.3%，可能的解释是：⑴这可能是广东地区HPV 感染的流行病学特点之一；⑵作者单位是广东地区最大的三甲医院之一，收治的皮肤疣患者病情可能比基层医院的复杂一些。图1 可以看出，双重或多重感染中，多数合并存在HPV 1，双重感染以HPV 1 合并HPV 4、或HPV 2、或HPV 27 等为主，多重感染以HPV 1 合并HPV4、HPV 27 为主；除HPV 18、58、94 之外，其余型别均存在合并感染。国外研究发现，HPV 1 感染的皮肤疣具有独特的临床特征，包括患者年龄＜12 岁、跖疣、病程＜6 个月、皮损部位少于4 个［23-25］。本研究绝大多数患者存在HPV 1 感染，与皮肤疣临床特征的关系不明显。但有研究表明，身体不同部位HPV 1 感染可导致不同临床表现的皮肤疣［18，26-27］。因此，HPV 1与非生殖器皮肤疣临床特征的关系值得进一步研究明确。此外，国外研究发现68 例希腊儿童皮肤疣组织中，33%检测到高危型HPV 16［28］；中国台湾61 例皮肤疣组织中HPV 16 占8%［29］。本研究3例寻常疣中检出高危型HPV 18，1例扁平疣中检出高危型HPV 58。目前随访期内我们尚不能明确这与临床预后的相关性，但检测结果促使我们更加关注这几例患者的随访，以期提前发现恶性转变的可能。

皮肤疣发病是多种诱因、生活方式、合并疾病以及密切接触史等多种因素综合所致［3］。本研究发现：皮肤疣患者中，学习工作压力大、熬夜、失眠等占很大比例。通过对头面部、躯干部、手部和足部等不同部位的皮肤疣患者分析发现一些规律。头面部疣病程最短，平均4 个月，疣体数目最少，这可能与头面部疣体最能影响美容，患者发病后常能及时就诊有关。其他诱因还包括面部多汗、合并手足癣、湿疹等。手部疣体数目多，女性患者占比70%，这可能与女性患者长期接触水及生鱼、肉等机会更多，皮肤接触面积大容易播散等有关。此外，手部多汗、合并手部湿疹、手足癣以及密切接触史等也是手部疣的重要诱因。足部疣病程长、疣体数目多，这可能与足部对美容影响小、患者就诊不及时有关。多数患者具有足部多汗史，一半患者有明确的足底皮损史，经常光脚、合并手足癣和湿疹等也是重要诱因［31］。此外，我们发现手足部疣体的双重∕多重HPV 感染比例占60%左右，明显高于头面部（26.67%），这可能与手足皮肤局部环境以及与外界环境接触等有关。

综上所述，本研究发现中山大学附属第一医院非生殖器皮肤疣患者的常见感染型别以HPV 1、27、2、4 为主，HPV 1 比例较高而HPV 57 比例较低；双重∕多重HPV 感染较多，特别是手足部疣，多数合并HPV 1；头面部、躯干部、手部、足部等不同部位的皮肤疣具有明显不同的诱因、病史和临床表现。对比国内外相关文献报道，以上研究结果提示广东地区非生殖器皮肤疣的HPV型别可能与其他地区不同，值得进一步扩大样本研究，并进一步分析常见HPV型别与临床表现和治疗预后的相关性。

作者贡献声明戴海蓉：研究实施，论文撰写；凌宏忠、曹光玲 ：研究指导，经费支持欧树玉、谢继璜 ：标本与数据采集；周晖：研究指导，论文修改。