寻常型银屑病皮损中CXCL8、miR-150表达与病情严重程度相关

马 卉，毕晓东

南阳市第一人民医院 皮肤科, 河南 南阳 473001

寻常型银屑病是一种慢性炎性皮肤病，主要表现为皮肤出现红斑、鳞屑，虽不会威胁患者生命，但病程较长，且反复发作，对患者身心健康及生活质量都会产生一定影响[1]。目前认为，银屑病的发生与感染、自身免疫、遗传等因素密切相关[2]。且有研究发现，多种细胞因子都参与银屑病的发生与发展[3]。CXC趋化因子配体8(CXC chemokine ligand 8，CXCL8)是一种促炎反应细胞因子，能够促进炎性反应发生，在多种炎性反应性疾病中发挥着重要作用[4]。miR-150是一种小分子RNA，其异常表达与细胞分化、增殖与凋亡过程密切相关[5]。多种研究表明，miR-150的异常表达可导致心血管疾病及癌等疾病的发生，但在寻常型银屑病中的表达情况研究较少。因此，本研究将探讨CXCL8、miR-150在银屑病患者皮损组织及正常组织中的表达情况，并分析CXCL8、miR-150表达水平与病情严重程度的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例：选取2020年1月至2021年5月在南阳市第一人民医院接受治疗的80例寻常型银屑病患者皮损组织作为研究对象，并选其皮损旁正常组织作为对照，男48例，女32例，病程0.5～13年，平均(7.1±2.4)年，年龄22～68岁，平均(38.5±7.3)岁。根据银屑病皮损面积与严重程度指数(psoriasis lesion area and severity index，PASI)评分对患者病情进行评定，轻度：PASI总分≤15分，中度：15分

1.1.2 试剂：RNA提取试剂盒(简石生物技术有限公司)，免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(上海经科化学科技有限公司)，基因组扩增试剂盒(江西江蓝纯生物试剂有限公司)，CXCL8一抗(北京索来宝生物科技有限公司)，生物素标记的二抗(北京普博斯生物科技有限公司)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)。CXCL8以GAPDH作为内参，CXCL8上游引物：5′-GTTGTAGCGTAGCTAGATGC-3′，下游引物：5′-TTCTCGTGTGCAGTATCTACG-3′，GAPDH上游引物：5′-GCACGCGTCACGGCTGAC AAC-3′，下游引物：5′-TGGTGCAGACGCTAGTGGA-3′；miR-150以U6作为内参，miR-150上游引物：5′-TCTCGCAACCGTTCTACCAGTC-3′，下游引物：5′-CAGTGCCTCTCGTCGAGT-3′，U6上游引物：5′-GTG CTCGATTCGGCACGACAT-3′，下游引物：5′-GTTTA AGCAGTTGGCAAGCTA-3′。

1.2 实验方法

1.2.1 实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)检测CXCL8 mRNA、miR-150表达水平：取出组织进行总RNA提取及反转录，采用罗氏LightCycler 480Ⅱ扩增仪进行扩增，扩增程序设置为95℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。每个样本重复3次，取平均值，采用2-△△Ct方法定量分析CXCL8 mRNA和miR-150表达水平。

1.2.2 免疫组化法检测CXCL8蛋白表达：组织经10%甲醛固定、DAB染色、苏木精复染等步骤后封片。在光学显微镜观察，记录阳性细胞，并以染色强度和阳性细胞比例进行评分，以评估CXCL8蛋白表达。

结果判定标准为：CXCL8蛋白阳性表达为细胞膜或细胞质中出现棕黄色颗粒，1)根据阳性细胞着色百分比进行评分。阳性细胞占比0～5%记0分；阳性细胞占比6%～25%记1分；阳性细胞占比26%～50%记2分；阳性细胞占比51%～75%记3分；阳性细胞占比>75%记4分。2)根据阳性细胞显色强度进行评分。0分为无着色；1分为淡黄色染色；2分为棕黄色染色；3分为棕褐色染色。总评分为两项评分结果的乘积，总分<4分为低表达，总分≥4分为高表达。

1.2.3 Western blot检测CXCL8蛋白表达：将组织剪成小碎片，转到新的预冷的离心管中加入配置好的冷Lysis Buffer，放入玻璃匀浆器中，在4 ℃14 000 r/min离心15min，得到蛋白提取物，定量后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离出的蛋白样品转至PVDF膜上。室温下采用5%脱脂牛奶封闭1 h，然后加入CXCL8一抗，4 ℃过夜孵育24 h，再加入相应二抗，室温下孵育1 h，以GAPDH作为内参，使用DAB显色试剂盒和ImageJ软件分析其蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CXCL8 mRNA、miR-150在组织中的表达水平

寻常型银屑病患者皮损组织中CXCL8 mRNA水平高于正常组织(P<0.05)，而miR-150水平低于正常组织(P<0.05)(表1)。

表1 CXCL8 mRNA、miR-150在银屑病患者皮损组织及正常组织中的表达水平

2.2 CXCL8蛋白在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达

寻常型银屑病患者皮损组织中CXCL8蛋白高表达率明显高于正常组织(P<0.05)(表2，图1)。

表2 CXCL8蛋白在寻常型银屑病患者皮损组织及正常组织中的表达

A.CXCL8 protein is highly expressed in normal tissue; B.CXCL8 protein was highly expressed in skin lesions图1 CXCL8蛋白在寻常型银屑病患者皮损组织及正常组织中表达的免疫组化图Fig 1 Immunohistochemical map of CXCL8 protein expression in skin lesions and normal tissues of patients with psoriasis vulgaris

2.3 Western blot检测CXCL8蛋白在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达水平

CXCL8蛋白在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达明显高于正常组织(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with normal tissue group图2 CXCL8蛋白在寻常型银屑病患者皮损组织及正常组织中表达的Western blot图及表达水平Fig 2 Western blot and expression level of CXCL8 protein in skin lesions and normal tissues of patients with

2.4 miR-150和CXCL8蛋白在不同病情分级银屑病患者中的表达水平

miR-150水平随着病情的加重逐渐降低(P<0.05)，CXCL8蛋白水平随着病情的加重逐渐升高(P<0.05)(表3)。

表3 miR-150和CXCL8蛋白在不同病情分级银屑病患者中的表达水平

2.5 寻常型银屑病患者miR-150和CXCL8蛋白水平之间的相关性及二者分别与PASI评分的相关性

寻常型银屑病患者miR-150水平与CXCL8蛋白水平及PASI评分之间均呈负相关(r=-0.467、-0.475，P<0.05)，CXCL8蛋白水平与PASI评分之间呈正相关(r=0.424，P<0.05)(表4)。

表4 寻常型银屑病患者miR-150和CXCL8蛋白水平之间的相关性及二者分别与PASI评分的相关性

3 讨论

有研究发现，寻常型银屑病的免疫因素主要受T淋巴细胞影响，T淋巴细胞活化后会释放大量白细胞介素，从而加重炎性反应，使患者皮损状况更加严重[8]。另有相关研究表明，CXCL8在肺炎支原体肺炎患儿中呈高表达，并且CXCL8可趋化炎性细胞到达肺组织，加重肺损伤程度[9]。本研究中，寻常型银屑病患者皮损组织中CXCL8 mRNA及蛋白水平均较正常组织高，且随着患者病情的加重，CXCL8蛋白表达水平逐渐升高，提示CXCL8可能参与寻常型银屑病的发展，检测其表达对评估患者病情进展有重要价值。另有结果显示，CXCL8蛋白水平与PASI评分呈正相关，进一步提示CXCL8可能与寻常型银屑病的病情严重程度存在紧密联系。

miR-150位于人类染色体19q13.33，是一种单链小分子RNA，能够调控靶基因，参与着多种疾病的发生与发展。miR-150在结直肠癌组织中呈低表达，能够通过调控p21、p53等因子的凋亡促进蛋白家族的抑制性成员的表达，从而发挥其抑癌作用[10]。本研究结果显示，寻常型银屑病患者皮损组织中miR-150水平低于正常组织，且随着病情的加重，miR-150水平逐渐降低，提示，miR-150水平的高低可反映病情的严重程度。本研究Pearson结果显示，寻常型银屑病患者miR-150水平与CXCL8蛋白水平及PASI评分均呈负相关，提示miR-150和CXCL8可能共同参与着寻常型银屑病的发生与发展，有望成为预测疾病严重程度的有效指标。

综上所述，miR-150在寻常型银屑病患者中表达降低，而CXCL8表达升高，二者与患者病情严重程度密切相关，可为寻常型银屑病的病情进展、临床诊断及治疗提供一定的参考价值。