异鼠李素减轻糖尿病视网膜病变大鼠视网膜细胞凋亡

王 卉，苏 宪，张赢赢，褚战亚，孙朝晖，张金玲，张倩倩

石家庄市人民医院 1.眼科； 2.门诊部，河北 石家庄 050030

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是常见糖尿病并发症，导致视力损害，DR发病的重要原因为视网膜神经细胞不可逆凋亡[1]。研究显示，氧化应激、炎性反应等多种因素参与了DR病理生理过程，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)等炎性因子参与血管内皮细胞及周细胞炎性反应和新血管生成，MAPK/NF-κB信号通路为炎性通路，在DR发生发展过程中发挥重要作用[2]。异鼠李素(isorhamnetin,ISO)是从沙棘、银杏等植物中提取的黄酮类物质，具有抗氧化、抗炎、保护内皮细胞的作用，研究显示[3]，异鼠李素可通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用，减轻高糖高脂诱导的胰岛β细胞损伤。本研究旨在观察异鼠李素对DR大鼠视网膜病变的影响，从MAPK/NF-κB信号通路探究异鼠李素对DR大鼠视网膜细胞凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级SD雄性大鼠(8～9周龄)，体质量180～220 g[中国医学科学院医学实验动物研究所，动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0011]，饲养条件：温度22～25 ℃，湿度45%～55%。

1.1.2 药物和试剂：异鼠李素(纯度≥98%，脉铂医药科技有限公司)；链脲佐菌素(streptozocin，STZ,Sigma-Aldrich公司)；羟苯磺酸钙(依比威药品有限公司)；苏木精伊红(HE)染色试剂盒和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(索莱宝生物科技公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6和ELISA检测试剂盒(Abcam公司)；兔抗鼠VEGF、Bax和caspase-3抗体(碧云天生物科技有限公司)；p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65抗体(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理：大鼠适应性饲养1周后，腹腔内注射STZ(60 mg/kg)进行造模[4]，每天1次，连续给药3 d，对照组(control组)注射等量的柠檬酸缓冲液，给药3 d后，尾静脉取血检测大鼠空腹血糖，此后每周检测1次，连续24周空腹血糖>16.7 mmol/L则为造模成功[5]。将大鼠分为对照组(control)、模型组(model)、异鼠李素低(ISO-L)组、高剂量(ISO-H)组(每日分别口服50、150 mg/kg异鼠李素)、阳性药物(positive drug)组(每日口服150 mg/kg羟苯磺酸钙)，model组与control组口服等量0.9%氯化钠溶液，每天1次，连续给药14 d。

1.2.2 HE染色检测视网膜组织：将包埋视网膜的石蜡切成4 μm的切片，经二甲苯和梯度乙醇常规脱蜡至水，自来水冲洗，经苏木精初染5 min和伊红复染4 min，显微镜观察各组大鼠视网膜病理变化。

1.2.3 TUNEL染色检测视网膜组织细胞凋亡：取各组大鼠视网膜组织石蜡切片，经二甲苯和梯度乙醇常规脱蜡至水，PBS洗涤2次，用蛋白酶K工作液处理15 min，按照TUNEL试剂盒说明进行染色，显微镜观察细胞凋亡，计算细胞凋亡率。

1.2.4 ELISA法检测血清炎性因子水平：按照试剂盒说明书，对血清进行稀释，根据说明操作步骤检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.5 Western blot法检测视网膜组织VEGF、Bax、caspase-3、p-p38MAPK、p38MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达：研磨视网膜组织后加入RIPA裂解液，离心提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度，取20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳并转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入VEGF、Bax、caspase-3、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65一抗稀释液，孵育过夜，再加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，ECL化学发光显影液显色。以β-actin为内参，计算VEGF、Bax、caspase-3蛋白相对表达水平，以p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65比值表示p38MAPK、NF-κB p65蛋白磷酸化水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 异鼠李素对DR大鼠视网膜组织病理学的影响

Model组大鼠视网膜排列紊乱，分界不清，内、外核层水肿，细胞数量减少，视网膜厚度变薄；ISO-L组、ISO-H组、阳性药物组大鼠视网膜组织各层界限较清晰，结构稍显疏松，视网膜厚度较model组增加(图1)。

2.2 异鼠李素对DR大鼠视网膜细胞凋亡的影响

凋亡细胞呈红色，model组较对照组大鼠视网膜细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与model组比较，ISO-L组、ISO-H组、阳性药物组大鼠视网膜细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，且ISO-H组大鼠视网膜细胞凋亡率显著低于ISO-L组(P<0.05)(图2，3)。

2.3 异鼠李素对DR大鼠血清炎性因子的影响

model组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著高于对照组(P<0.05)；与model组比较，ISO-L组、ISO-H组、阳性药物组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05)(图4)。

2.4 异鼠李素对DR大鼠视网膜组织VEGF、Bax、caspase-3蛋白表达的影响

与对照组比较，model组大鼠视网膜组织VEGF、Bax、caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与model组比较，ISO-L组、ISO-H组、阳性药物组大鼠视网膜组织VEGF、Bax、caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)(图5，6)。

图1 异鼠李素对大鼠视网膜组织病理学的影响Fig 1 Effect of isorhamnetin on histopathological changes of rat retina

图2 异鼠李素对DR大鼠视网膜细胞凋亡的影响Fig 2 Effect of isorhamnetin on retinal cell apoptosis in DR rats

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group图3 各组大鼠视网膜细胞凋亡率比较Fig 3 Compared of apoptosis rate of retinal cells in each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group图4 各组大鼠血清炎性因子水平比较Fig 4 Compared of serum inflammatory factor levels in each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group图5 各组大鼠视网膜组织VEGF、Bax、caspase-3蛋白表达Fig 5 Expression of VEGF, Bax and caspase-3 protein in retina of each group

2.5 异鼠李素对DR大鼠视网膜组织p38 MAPK、NF-κB p65磷酸化蛋白表达的影响

Model组DR大鼠视网膜组织p38 MAPK、NF-κB p65的磷酸化水平较control显著升高(P<0.05)；与model组比较，ISO-L组、ISO-H组、阳性药物组大鼠视网膜组织p38 MAPK、NF-κB p65的磷酸化水平显著降低(P<0.05)(图6)。

3 讨论

DR是糖尿病常见微血管并发症，主要损伤视网膜的结构和功能，造成视力损伤甚至失明[6]。研究显示，DR发病机制复杂，主要与视网膜微血管病变、炎性反应、氧化应激等有关[7]。DR的损伤程度与VEGF密切相关，VEGF在视网膜新生血管形成中发挥重要作用[8]。本研究建立DR模型，结果表明DR大鼠中炎性反应及视网膜VEGF和细胞凋亡水平升高，与以往报道[9]类似，提示造模成功。

异鼠李素具有抗炎、抗氧化的作用，具有保护血管内皮细胞等作用。研究显示[10]，异鼠李素可通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制过氧化氢诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞活性氧产生和caspase-3活化，保护人RPE细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡。另有研究显示[11]，异鼠李素可显著抑制脂多糖诱导的小胶质细胞中TNF-α、IL-1β等炎性因子的释放，且与抑制NF-κB信号通路、阻断TLR4通路、减少活性氧产生有关。本研究结果显示，与model组比较，ISO-L组、ISO-H组大鼠视网膜组织各层界限较清晰，结构稍显疏松，视网膜厚度增加，视网膜细胞凋亡率、血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平、VEGF、Bax、caspase-3蛋白表达水平显著降低， 与口服阳性药物羟苯磺酸钙的作用类似，表明异鼠李素可改善DR大鼠视网膜组织损伤及细胞凋亡。

p38 MAPK信号通路与机体的氧化应激反应和炎性反应密切相关；NF-κB是p38 MAPK的下游通路分子，p38 MAPK磷酸化后可激活NF-κB通路，并激活VEGF，调节新血管生成，加重组织损伤；抑制p38 MAPK信号通路，可保护DR大鼠视网膜神经节细胞损伤[12]。研究显示，褪黑素可以通过抑制p38/NF-κB通路上调紧密连接蛋白的表达来维持DR中血-视网膜屏障的完整性，从而减少炎性因子的产生[13]。本研究结果表明异鼠李素可能有抑制MAPK/NF-κB信号通路的作用，提示异鼠李素可能通过抑制MAPK/NF-κB信号通路而改善DR大鼠视网膜损伤及细胞凋亡。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group图6 各组大鼠视网膜组织p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达Fig 6 The protein expressions of p-p38 MAPK, p38 MAPK, p-NF-κB p65 and NF-κB p65 in retina tissue of each group