咪达唑仑减轻缺氧/复氧诱导的小鼠海马神经元损伤

魏健强，张春瑞

1.延安大学附属医院 神经血管介入治疗中心， 陕西 延安 716000; 2.汉中市人民医院 神经内科， 陕西 汉中 723000

缺血性卒中是病死率、残疾率均很高的常见神经系统疾病，在中国发病率较高，也是导致居民死亡的主要原因之一[1]。脑组织神经元在脑卒中的发病及治疗中可因缺氧/复氧过程造成大量凋亡，引发严重的神经功能障碍，炎性反应和氧化应激反应在其中扮演着重要角色，减轻脑内炎性反应、增强抗氧化功能是抑制脑神经元凋亡、改善脑缺血再灌注损伤的有效方法[2]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)通路与糖尿病、牙周炎、神经炎性反应等炎性疾病发生发展密切相关，降低其通路蛋白磷酸化水平可明显减少促炎细胞因子表达分泌，抑制牙周炎性反应[3]，并可抑制缺血性中风体内外模型中神经元凋亡，减轻神经炎性反应导致的脑组织病理学改变，保护神经功能[4-5]。咪达唑仑是临床常用的镇静麻醉药物，可提高缺血缺氧性新生大鼠抗氧化能力，抑制缺血缺氧引发的神经炎性反应，下调凋亡蛋白表达，减轻神经元凋亡及脑损伤，改善大鼠的神经行为功能障碍[6]。因而推测咪达唑仑可能通过抑制MAPK/NF-κB信号通路激活减轻缺氧/复氧诱导的神经元损伤，本文以咪达唑仑处理体外培养的缺氧/复氧诱导的神经元损伤模型，对此假设进行探究。

1 材料与方法

1.1 材料

咪达唑仑(纯度98%，上海创赛科技有限公司)；MAPK激活剂C16-PAF(Biomedsci公司)；小鼠海马神经元完全培养基和小鼠海马神经元(武汉普诺赛生命科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和甲基噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；小鼠白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒、小鼠白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)ELISA试剂盒、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性测定试剂盒、兔源抗小鼠β肌动蛋白(β-actin)一抗、兔源抗小鼠半胱氨酸蛋白酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9，caspase-9)一抗、兔源抗小鼠Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白检测试剂盒(Abcam公司)；兔源抗小鼠NF-κB p65一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、兔源抗小鼠p-NF-κB p65一抗、兔源抗小鼠p-p38 MAPK一抗和兔源抗小鼠p38 MAPK一抗(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及咪达唑仑最佳作用浓度筛选：复苏海马神经元，离心后以其完全培养基洗涤，置于常氧培养箱(37 ℃、5% CO2)中无菌培养，接着0、5、10、40、70、100 ng/mL咪达唑仑[7]处理，每个药物浓度6个孔，另选未接种细胞的6个孔作为空白对照，24 h后采用MTT试剂盒测量各孔吸光值，具体按照试剂盒说明书操作，计算出不同浓度咪达唑仑处理后的细胞活力=(咪达唑仑处理组细胞吸光值-空白对照组吸光值)/(咪达唑仑未处理组(0 ng/mL)吸光值-空白对照组吸光值)×100%。

1.2.2 细胞的分组处理及收集材料：贴壁培养12 h后，随机分为:1)对照组;2)模型组:长满瓶底后以0.5×106个/mL传代接种在96孔板中，细胞贴壁24 h后，置于三气培养箱(37 ℃、5% CO2、95% N2)中缺氧3 h后马上置于常氧培养箱中复氧12 h，诱导缺氧/复氧神经元损伤模型[8];3)咪达唑仑组:以70 ng/mL的咪达唑仑处理;4)C16-PAF组:以终浓度4 μmol/L的C16-PAF[9]处理;5)咪达唑仑+C16-PAF联合处理组。24 h后收集各组细胞沉淀及培养液。

1.2.3 Hoechst33258染色和流式细胞检测细胞凋亡情况：以磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)漂洗细胞1次，以Hoechst 33258染液避光孵育5 min，再次以PBS漂洗1次后，置于荧光显微镜下观察各组细胞着色情况并任选3个视野拍照。

以PBS分别重悬后计数，根据计数结果取约0.5×106个细胞，离心后PBS洗涤，采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况，具体按照试剂盒说明书操作，以Muticycle AV软件分析所获数据，得出各组细胞凋亡率。

1.2.4 ELISA测定细胞LDH、TNF-α、IL-18、IL-17释放量及细胞SOD、CAT活性：取出细胞沉淀，经RIPA裂解液裂解提取总蛋白后，以BCA试剂盒测出其浓度，以各自试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 Western blot检测细胞凋亡蛋白及MAPK/NF-κB通路蛋白表达：取出细胞沉淀，经RIPA裂解液裂解提取总蛋白后，以BCA试剂盒测出其浓度，每组各取20 μg煮沸变性后跑电泳分离，通过湿转实验将其转印到硝酸纤维膜上，以3%牛血清白蛋白溶液封闭蛋白非特异位点后自膜上裁下β-actin、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、caspase-9、Bax蛋白条带，通过全自动蛋白印迹系统孵育一抗、孵育二抗并洗涤后显色，采集图像后运用Image J软件进行对蛋白表达进行定量后统计，最后得到各组蛋白相对表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 咪达唑仑对缺氧/复氧神经元活力的影响

咪达唑仑随剂量升高增强缺氧/复氧神经元活力，达到70 ng/mL时，细胞活力基本不再增强，进入平台期，因此后续实验选用70 ng/mL咪达唑仑处理缺氧/复氧神经元(图1)。

2.2 咪达唑仑对缺氧/复氧神经元凋亡的影响

对照组神经元核圆且大，染为微弱的蓝色；模型组、咪达唑仑+C16-PAF组神经元核固缩，大小不一，染为较强的蓝色；咪达唑仑组神经元核相比模型组变大变圆，蓝色染色变浅；C16-PAF组神经元核相比模型组更加固缩，蓝色染色变深(图2)。与对照组(3.73±0.91)比较，模型组(46.15±5.27)神经元凋亡率明显升高(P<0.05)。与模型组(46.15±5.27)、咪达唑仑+C16-PAF组(42.92±6.04)分别比较，咪达唑仑组(6.02±2.82)神经元凋亡率均降低(P<0.05)；C16-PAF组(67.59±3.85)神经元凋亡率均升高(P<0.05)(图3，表1)。

2.3 咪达唑仑对缺氧/复氧神经元抗氧化酶CAT、SOD水平及LDH释放量的影响

与对照组比较，模型组神经元LDH释放量明显升高(P<0.05)，细胞抗氧化酶CAT、SOD水平明显降低(P<0.05)。与模型组、咪达唑仑+C16-PAF组分别比较，咪达唑仑组神经元LDH释放量均降低(P<0.05)，细胞抗氧化酶CAT、SOD活性均升高(P<0.05)；C16-PAF组神经元LDH释放量均升高(P<0.05)，细胞抗氧化酶CAT、SOD活性均降低(P<0.05)(表1)。

2.4 咪达唑仑对缺氧/复氧神经元炎性因子TNF-α、IL-17、IL-18释放量的影响

与对照组比较，模型组神经元炎性因子TNF-α、IL-17、IL-18释放量明显升高(P<0.05)。与模型组、咪达唑仑+C16-PAF组分别比较，咪达唑仑组神经元炎性因子TNF-α、IL-17、IL-18释放量均降低(P<0.05)；C16-PAF组神经元炎性因子TNF-α、IL-17、IL-18释放量均升高(P<0.05)(表2)。

2.5 咪达唑仑对缺氧/复氧神经元凋亡蛋白及MAPK/NF-κB通路蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组神经元凋亡蛋白caspase-9、Bax表达及MAPK/NF-κB通路p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平明显升高(P<0.05)。与模型组、咪达唑仑+C16-PAF组分别比较，咪达唑仑组神经元凋亡蛋白caspase-9、Bax表达及MAPK/NF-κB通路p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均降低(P<0.05)；C16-PAF组神经元凋亡蛋白caspase-9、Bax表达及MAPK/NF-κB通路p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均升高(P<0.05)(表3,图4)。

A.control group; B.model group; C.midazolam group; D.C16-PAF group; E.midazolam +C16-PAF group图2 Hoechst33258染色检测神经元凋亡形态Fig 2 Hoechst33258 staining to detect apoptosis morphology of neurons(×400)

A.control group; B.model group; C.midazolam group; D.C16-PAF group; E.midazolam +C16-PAF group图3 流式细胞术检测神经元凋亡Fig 3 Detection of neuronal apoptosis by flow cytometry

表1 各组神经元抗氧化酶CAT、SOD水平及LDH释放量Table 1 Levels of antioxidant enzymes CAT, SOD and LDH release of neurons in each group

表2 各组神经元细胞炎性因子TNF-α、IL-17、IL-18释放量Table 2 Neuronal inflammatory factor release amount of TNF-α， IL-17 and IL-18 in each

3 讨论

神经元凋亡是脑缺血再灌注损伤中的重要病理过程，受到多种机制的复杂调控，探讨研究其调控机制及进行过程，对缺血性卒中引发的脑损伤进行防治具有积极理论和实用价值[10]。小胶质细胞激活活引发的氧化应激和炎性因子因子过度表达是缺血性脑损伤的主要病理机制，而严重的氧化应激及炎性因子可导致缺血性脑损伤的体外模型中神经元大量凋亡，因此针对氧化应激、细胞凋亡和炎性因子进行抑制， 可有效减轻脑卒中后神经系统损伤[11]。咪达唑仑可降低大鼠海马区细胞死亡受体表达，减轻其神经细胞损伤，改善大鼠学习记忆功能[12]，并可明显改善重症脑损伤患者脑代谢指标， 缓解其临床症状[13]。本实验以不同浓度咪达唑仑干预缺氧/复氧处理后的神经元，可提升其细胞活力，在一定范围内，随浓度升高而作用增强，以70 ng/mL咪达唑仑干预缺氧/复氧处理后的神经元，可明显提升抗氧化酶CAT、SOD活性，降低促炎细胞因子TNF-α、IL-18、IL-17释放量，进而抑制LDH释放及凋亡蛋白caspase-9、Bax表达，减轻神经元损伤，降低其凋亡率，表明咪达唑仑具有较强的抗感染、抗氧化作用，可显著抑制缺氧/复氧处理后的神经元凋亡，进一步证实了咪达唑仑对缺血性脑损伤的治疗作用。

表3 各组神经元凋亡蛋白及MAPK/NF-κB通路蛋白相对表达水平

图4 各组神经元凋亡蛋白及MAPK/NF-κB通路蛋白表达Fig 4 Expression of neuronal apoptotic protein and MAPK/NF-κB pathway protein in each group

MAPK是机体典型的神经炎性因子及应激反应信号，在神经元增殖、代谢及突触可塑性等方面起到中心调控作用， 特异性抑制其激活可改善阿尔茨海默病小鼠突触可塑性， 缓解其记忆缺陷[14]；NF-κB是其下游信号分子，抑制p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化，可明显减弱缺血性卒中体内外模型中的炎性因子反应，缓解其神经细胞损伤[15]，由此可知MAPK/NF-κB是重要的缺血性脑损伤治疗靶点。提示咪达唑仑可通过抑制MAPK/NF-κB信号激活减轻缺氧/复氧神经元损伤。