血清miR-23b-3p、IL-18水平与肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿的病情及预后的关系

李敏，张迎辉

(1.新乡医学院基础医学院，河南 新乡 450003；2.郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院 呼吸科，河南 郑州 450000)

肺炎支原体感染所致肺炎是儿童常见的肺部感染性疾病，约占儿童社区获得性肺炎的10%～40%[1]。儿童由于自身组织器官、免疫系统功能发育不完全，感染肺炎支原体后进展较快，极易引起肺内外多器官功能衰竭，进而进展为重症肺炎，此类患儿预后较差[2]。在临床诊疗中，重症肺炎病情及预后的准确评估对指导临床治疗具有重要意义。现阶段临床常用的相关评估指标包括C反应蛋白、降钙素原及白细胞等，但此类指标特异性较差，评估价值有限[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)近年来广泛应用于呼吸系统疾病研究，其中miR-23b-3p是目前已知的具有抗炎作用的miRNA，其与肺炎的发生密切相关，但具体机制并不清楚[4]。白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)是一种前炎症细胞因子，其介导的宿主免疫反应在肺炎支原体感染所致肺炎过程中发挥重要作用[5]。鉴于此，本研究分析血清miR-23b-3p、IL-18水平与肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿的病情及预后的关系，以期为患儿的早期诊治提供帮助。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2019年1月至2022年1月于郑州大学附属儿童医院诊治的163例肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿作为研究对象(重症肺炎组)，根据患儿28 d内预后情况分为预后不良组(48例)和预后良好组(115例)，其中预后不良定义为死亡、肺部感染症状及并发症控制不佳、其他系统受累控制不佳等。另选取同期收治的95例普通肺炎支原体肺炎患儿作为对照(普通肺炎组)。普通肺炎组入组标准[6]：血清学检测肺炎支原体-IgM/IgG抗体滴度超过1∶160，血清或肺泡灌洗液肺炎支原体-DNA阳性，二者中至少一项阳性即为肺炎支原体感染。重症肺炎组入组标准[6]：(1)胸部X线显示超过1/3以上肺野受累或合并肺不张、胸腔积液等肺内并发症；(2)心力衰竭、微循环障碍、水电解质紊乱、中毒性脑病等多器官功能受累。排除标准：(1)既往先天性心脏病、肝肾疾病、支气管哮喘等疾病；(2)先天性支气管发育不良；(3)合并吸入性肺炎、细菌性肺炎等感染性疾病；(4)意识障碍；(5)恶性肿瘤。入组患儿家属均签署知情同意书，本研究已经获得医院伦理委员会的审批同意。

1.2 研究方法

1.2.1生化指标的检测 抽取入组儿童清晨空腹静脉血10 mL(3份)，1份2 h内以1 500 r·min-1离心5 min(离心半径14 cm)后提取上清，置于-70 ℃冷藏设备中备用。严格按照检测试剂盒操作说明，使用双抗体酶联免疫吸附法检测血清中白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)，检测试剂盒均购于上海钰博生物科技有限公司。使用迈瑞BC-500全自动血细胞分析仪(南京贝登医疗股份有限公司)检测血样中白细胞计数(white blood cell，WBC)数目及血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)。

1.2.2血清miR-23b-3p的检测 使用miRNA提取试剂盒(天根公司，北京)提取全血样本中miRNA，后使用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)体系检测血清中miR-23b-3p的表达，具体步骤如下：所提取miRNA经逆转录cDNA试剂盒(天根公司，北京)合成cDNA，以cDNA模板使用qRT-PCR扩增仪(普迪生物科技有限公司，上海)对miR-23b-3p及内参考物(U6)进行扩增(扩增液—cDNA—引物—94 ℃预变性3 min—95 ℃变性15 s—退火—60 ℃延伸40 s—40个循环)。引物序列：miR-23b-3p(上游：CACAAAGGCATCTCTACGCCCATC，下游：TGTAGCTGCC TCGCCAGAGGC)、内参考物U6(上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT)。使用2-ΔΔCt(ΔCt=样品Ct均值-内参Ct均值)法对miR-23b-3p的表达进行定量分析。

1.2.3小儿危重病例评分(pediatric critical case score，PCIS) 此评分为肺炎患儿病情严重程度评分，包括胃肠系统、血压、呼吸频率、动脉血氧分压、pH值、血钠、血钾、血尿素氮/肌酐、血红蛋白、心率等，评分越低认为对应维度的异常情况越严重，总分为100分，评分越低认为病情越严重。

2 结果

2.1 重症肺炎组与普通肺炎组患儿血清miR-23b-3p、IL-18水平及其他指标的变化重症肺炎组患儿血清miR-23b-3p水平、PCIS评分低于普通肺炎组(P<0.05)，而血清IL-18、CRP、PCT、ESR、WBC水平高于普通肺炎组(P<0.05)。两组患儿的年龄、性别、体质量差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 重症肺炎组与普通肺炎组血清miR-23b-3p、IL-18水平及其他指标的变化

2.2 重症肺炎组患儿血清miR-23b-3p、IL-18与相关指标的相关性重症肺炎组患儿血清miR-23b-3p与PCT、WBC均呈负相关，而与PCIS评分呈正相关。重症肺炎组患儿血清IL-18与CRP、PCT、WBC均呈正相关，而与PCIS评分呈负相关。见表2。

表2 重症肺炎组患儿血清miR-23b-3p、IL-18与相关指标的相关性

2.3 重症肺炎组患儿不同预后血清miR-23b-3p、IL-18水平的比较预后不良组患儿血清miR-23b-3p水平低于预后良好组，而IL-18水平高于预后良好组(P<0.05)。见表3。

表3 重症肺炎组患儿不同预后血清miR-23b-3p、IL-18水平的比较

2.4 血清miR-23b-3p、IL-18对肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿预后不良的预测价值miR-23b-3p、IL-18预测肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿预后不良的AUC分别为0.791、0.779，二者联合预测的AUC为0.857。见表4。

表4 血清miR-23b-3p、IL-18对肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿预后不良的预测价值

3 讨论

肺炎支原体是儿童社区获得性肺炎的主要病原之一，多见于5岁左右儿童，且其所致重症肺炎逐渐增多，起病急，病情进展较快，较早出现发热及全身感染性中毒症状，喘息缺氧及呼吸困难症状明显，多累及肺外器官，且近年来耐药病例逐渐增多，导致患儿预后较差[7-8]。本研究观察到肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿预后不良发生率高达29.44%，提示患儿预后较差。肺炎支原体致病机制主要包括两方面：一方面支原体进入呼吸道黏膜后释放过氧化氢等有害物质破坏纤毛；另一方面激活机体体液及细胞免疫引发肺内局部大量炎症因子、炎症细胞释放，引发级联式炎症反应[9]。本研究发现肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿CRP、PCT、ESR、WBC水平较普通肺炎升高，PCIS评分降低，可能是肺泡上皮血管内皮细胞受肺炎支原体及其毒素破坏后，粒细胞及炎症因子迅速释放而引发炎症反应[10]，进而加重患儿病情。WBC、CRP等是临床常用的评估重症肺炎病情的指标，但其特异性及敏感性较低，常常贻误诊疗时机[11]。因此，积极追寻有效评估重症肺炎病情及预后的生物学指标仍是临床工作之重心。

miRNA是近年来呼吸系统疾病研究的重点，是一类机体内高度保守的内源性非编码核苷酸小分子物质，可通过与相邻区域的非编码miRNA调节子结合，调控目标信使RNA的表达进而调控基因的转录，与体内炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等众多生物学进程密切相关[12-13]。人类miR-23b-3p定位于第9号染色体，其分布广泛，可通过对肿瘤坏死因子-α、IL-1β、IL-17等众多炎症因子的调节抑制而发挥抗炎作用[14]。戴彩同等[15]研究发现细菌感染可抑制肺泡上皮细胞中miR-23b-3p的表达，且调节其表达上调后，肺泡上皮细胞对白细胞介素-6、白细胞介素-10的释放明显减少，说明miR-23b-3p可下调炎症因子的表达而发挥抗炎作用。吴英等[16]的研究发现重症肺炎患儿外周血miR-23b-3p水平明显降低，且相对高miR-23b-3p表达患儿外周血中肿瘤坏死因子-α、IL-6等炎症因子表达降低，且其对患儿28 d生存情况具有较好的预测价值，提示miR-23b-3p可通过抑制炎症因子的释放进而改善患者预后。本研究结果证实肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿血清miR-23b-3p明显降低，且与相关炎症指标均呈负相关，而与PCIS评分呈正相关，说明其不仅可以反映患儿体内炎症反应状态，还可以反映患儿病情严重程度，此可为临床治疗提供方向。此外，本研究还显示miR-23b-3p对肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿预后不良具有较高的预测价值，提示其与肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿的发生及疾病转归具有较好的量化关系。与既往的研究[15-16]相比，本研究进一步阐述了其与肺炎支原体感染所致重症肺炎病情及预后具体的量化关系，笔者推测血清miR-23b-3p通过抑制肿瘤坏死因子-α、白细胞介素等炎症因子的释放进而发挥抗炎作用，患儿血清miR-23b-3p水平的下降可能是其发挥生物学作用而出现消耗性降低。

IL-18是机体单核巨噬细胞系统及外树突状细胞分泌的重要细胞因子，其结构的活化、信号的转导过程与IL-1β类似，功能上与IL-12相似[17]。IL-18主要通过激活巨噬细胞和自然杀伤细胞产生干扰素，还可以激活多种促炎因子及细胞效应因子，促进辅助性T细胞1的增值、促进NK细胞及细胞毒T细胞表达FasL，进而引起细胞炎症凋亡[18-19]。有研究显示血清IL-18与支原体肺炎患儿肺部纤维化及喘息密切相关[20]。还有研究发现支原体肺炎血清IL-18与CRP呈强正相关，且与患儿病情程度密切相关[21]。这都提示IL-18可能是肺炎支原体肺炎病情进展的重要促进因素。本研究发现肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿血清IL-18升高，且其与CRP、PCT、WBC等炎症指标呈正相关，而与PCIS评分呈负相关，提示IL-18可能促进患儿肺部炎症反应，并加重患儿病情。既往研究也显示IL-18与肺炎存在联系，但具体量化关系并未报道。本研究通过ROC分析显示血清IL-18对肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿不良预后具有较高的预测价值，进一步证实了其临床价值，也为患儿的早期干预提供了充分的理论依据。

综上所述，肺炎支原体感染所致重症肺炎患儿血清miR-23b-3p水平降低，IL-18水平升高，二者与患儿病情及预后均具有较好的量化关系，二者有望成为肺炎支原体感染所致重症肺炎诊疗的新靶点。此外，本研究亦有不足之处，属于单中心研究，结果可能具有一定的偏倚，未来应设计更多的多中心研究来验证。