脐带间充质干细胞在亲缘单倍型造血干细胞移植治疗难治性重型再生障碍性贫血中的应用

袁芳芳，宗上纲，李明会，马楠，王勇奇，李钢苹，李子夜，符粤文，王莉

(1.郑州大学附属肿瘤医院 血液科，河南 郑州 450000；2.河南省医学科学院 干细胞和再生医学研究和转化中心，河南 郑州 450000)

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)是一种以全血细胞减少为主要表现的获得性骨髓衰竭性疾病，其治疗选择取决于疾病严重程度、供者可及性和患者年龄[1-2]。有人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)相合同胞供者的年轻重型再生障碍性贫血(severe aplastic anemia，SAA)患者首选异基因造血干细胞移植(allogeneic stem cell transplantation，Allo-HSCT)，总生存率>80%[3-4]，而无HLA相合同胞供者的年轻患者和年龄>40岁的患者，首选免疫抑制治疗(immunosuppressive therapy，IST)。但IST治疗长期应答率较低，约25%的患者在IST治疗后仍不能脱离输血，血象及骨髓象仍符合SAA诊断标准，称为难治性SAA[5-6]。对于无同胞全相合供者的难治性重型再生障碍性贫血(refractory severe aplastic anemia，RSAA)患者，可选择替代供者如非血缘供者(matched unrelated donor，MUD)、亲缘单倍型供者(haploidentical donor，HID)进行Allo-HSCT[7-9]。然而，RSAA患者多病史较长，输血较多且长期口服免疫抑制剂，存在铁过载、器官功能损伤，大大增加了移植风险。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是多能的非造血祖细胞，可支持造血，增强HSCT植入，并降低移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的发病率[10-12]。相比骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSCs)，脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)体外增殖更快，更易获得，免疫原性更低且具有更强的免疫抑制作用[13-16]。因此，本研究采用UC-MSCs与单倍型供者干细胞共同输注以改善单倍型造血干细胞移植(haploidentical hematopoietic stem cell transplantation，Haplo-HSCT)治疗RSAA的效果。现对18例应用该方案进行Allo-HSCT的患者进行回顾性分析并报告如下。

1 病例与方法

1.1 纳入病例本回顾性研究纳入2016年1月至2020年12月在郑州大学附属肿瘤医院接受HID造血干细胞联合UC-MSCs共移植的18例RSAA患者，均为首次移植。所有患者均符合诊断标准[17]。患者的供者来自其父亲或同胞，采用高分辨基因分型检测方法，分别检测供受者的HLA-A、B、DR、DQ、Cw共10个位点。所有供者均符合捐献条件且自愿捐赠造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)。本研究已获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 预处理方案所有患者均接受以免疫抑制为主的减低剂量预处理方案，以氟达拉滨+抗胸腺细胞球蛋白+环磷酰胺±低剂量全身照射±白消安，5例患者加用2～3 Gy全身照射，3例患者加用白消安。

1.3 HSC动员、采集和回输所有患者均有UC-MSCs的联合输注，UC-MSCs来自山东省脐血库/山东省齐鲁干细胞工程有限公司，输注前常规进行细胞活性、细胞表型及内毒素检测，于HID干细胞输注前4 h进行输注，剂量为(1～2)×106kg-1，每例患者均从单个供体获得UC-MSCs。对单倍型供者每日皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rh-G-CSF)5 μg·kg-1进行HSC动员，连续5～6 d，父供者于第5天时采集供者骨髓5～8 mL·kg-1(以受者体质量)，第6天应用费森尤斯血细胞分离机采集供者外周血干细胞(peripheral blood stem cells， PBSC)，同胞供者于第5天采集PBSC。UC-MSCs回输后4 h输注供者骨髓或供者PBSC。采集后的干细胞经流式细胞仪进行MNC、CD34+细胞计数。

1.4 GVHD的预防、诊断和分级所有患者均接受环孢素A(cyclosporine，CsA)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)、短程甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)预防GVHD。具体用量：静脉应用CsA 2.5～3.0 mg·kg-1·d-1，-7 d始(以干细胞回输当天为第0天，回输前为-，回输后为+)至胃肠道功能恢复后，改为口服，血药浓度维持在150～250 μg·L-1，口服至移植后 1 a逐渐减量。每12 h口服MMF 15 mg·kg-1，-7 d～+30 d，+31 d剂量减半，+60 d停用；短疗程静脉应用MTX 15 mg·m-2+1 d，10 mg·m-2+3 d、+6 d、+11 d。当出现Ⅱ度及以上的急性GVHD时，采用甲泼尼龙一线治疗，必要时加用抗CD25单抗、芦可替尼等免疫抑制剂治疗。采用甲泼尼龙、CsA、芦可替尼等治疗慢性GVHD。急、慢性GVHD的诊断和分级分别依据西雅图标准和NIH标准[18-19]。

1.5 支持治疗所有患者均入住百级层流病房，给予更昔洛韦预防病毒感染，预防性应用抗真菌药物。预处理过程中加强水化、碱化。+4 d始给予皮下注射rh-G-CSF及重组人血小板生成素，移植期间输注的红细胞及血小板均经辐照处理。粒系植入后每周1～2次检测巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)拷贝数，必要时应用更昔洛韦、膦甲酸钠抗CMV治疗，应用利妥昔单抗抗EBV治疗。

1.6 植入标准及嵌合体检测以外周血中性粒细胞绝对计数>0.5×109L-1连续3 d的第1天为粒细胞植入，血小板计数>20×109L-1连续7 d且脱离输注的第1天为血小板植入。采用DNA短串联重复序列-聚合酶链式反应检测嵌合体，移植后+28 d首次检测嵌合体，供体细胞比例≥95%报告为完全供体嵌合状态；供体细胞比例>5%且<95%报告为混合嵌合状态；≤5%报告为完全患者嵌合状态。

1.7 生存、随访及统计分析随访至2022年6月30日，总生存时间定义为干细胞回输日至随访截止或死亡日期。应用SPSS 25.0软件绘制生存曲线，采用Kaplan-Meier法计算中位生存期。

2 结果

2.1 病例特征18例患者中男10例，女8例，中位年龄15(6～32)岁，诊断至移植的中位时间为21.40(7.90～145.30)个月， SAA 6例， 极重型再生障碍性贫血(very severe aplastic anemia，VSAA) 2例，2例患者移植前存在活动性感染，18例患者移植前血清铁蛋白均高于正常，中位血清铁蛋白为3 517(948～13 460)μg·L-1。供受者HLA相合情况：15例供者为HLA 5/10相合，2例为6/10，1例为7/10。15例为父供，其余3例为同胞供者。ABO血型相合移植12例，不合移植6例。所有患者回输骨髓和PBSC总的MNC和CD34+细胞中位数分别为10.40(5.13～25.93)×108kg-1、4.80(2.31～18.42)×106kg-1。18例患者临床资料见表1。

表1 18例RSAA患者临床特征及供者情况

2.2 植入情况所有患者均获得粒系植入，粒细胞植入的中位时间为13(11～23)d，+30 d粒系累积植入率为100.00%，17例患者血小板植入，血小板植入的中位时间为14(12～26)d， +100 d巨核系累积植入率为94.40%，1例患者于巨核系植入前死于颅内出血。+28 d首次检测嵌合体，18例患者均达到完全供者嵌合。18例患者植入及嵌合情况见表2。

表2 18例RSAA患者临床转归

表2(续)

2.3 GVHD发生情况移植后100 d内共8例患者发生aGVHD，中位aGVHD发生时间为28.0(15.0～91.0)d，Ⅰ/Ⅱ度急性GVHD、Ⅲ度急性GVHD、慢性GVHD发生率分别为38.89%(7/18)、5.56%(1/18)、23.53%(4/17)，17例患者移植后生存超过100 d，其中4例(23.50%)发生cGVHD，3例为局限型，1例为广泛型，中位发生时间为8.3(4.3～16.0)个月。1例Ⅲ度aGVHD患者及1例广泛型cGVHD患者累及皮肤、肠道、肝脏、中枢，应用激素、抗CD25单抗、CsA、粪菌移植等治疗无明显改善，最终死于aGVHD及感染，其余急、慢性GVHD患者经治疗后均得到控制。

2.4 移植后感染及其他并发症18例患者中有6例(33.30%)移植后出现CMV再激活，无CMV病发生，给予更昔洛韦、膦甲酸钠、静注人免疫球蛋白等治疗后CMV感染控制。共有8例(44.40%)患者移植后出现EBV再激活，其中5例为自限性，其余3例[其中1例移植后淋巴组织增生性疾病(post-transplantation lymphoproliferative disorders，PTLD)]经利妥昔单抗治疗后好转。共有10例患者移植后发生出血性膀胱炎，经水化、碱化、抗病毒等支持治疗均好转。共5例(27.77%)患者移植后合并细菌和/或真菌感染。无患者出现肝静脉闭塞病、闭塞性细支气管炎、移植相关性血栓性微血管病等移植相关并发症。

2.5 生存情况移植后中位随访时间32.97(1.60～63.67)个月，18例患者中3例死亡，其中2例死于GVHD合并重症感染，1例死于出血并发症，15例生存，3 a总生存率为(83.3±8.8)%，15例存活患者均脱离输血依赖，血象恢复正常，生活质量良好。18例患者生存曲线见图1。

图1 18例RSAA患者移植后生存曲线(K-M法)

3 讨论

一线IST治疗失败的RSAA患者接受替代供者HSCT的预后显著优于接受二次IST治疗(移植组FFS 83.9%，二次IST组FFS 9.5%)[20]，因此对于年轻的RSAA患者，应及早行Allo-HSCT。Haplo-HSCT主要受限于植入失败和GVHD的高发率[7,21-22]，总生存率为64.6%～89.0%[7-9]。MSCs是多能的非造血祖细胞，可从多种组织获得，包括骨髓、脐带、脂肪组织和胎盘，不同组织来源的MSCs具有不同的生物学特性。大量研究表明，MSCs通过调节多种免疫细胞的增殖和功能而具有免疫调节特性，例如，抑制单核细胞分化为树突状细胞，改变树突状细胞的细胞因子谱，导致调节性细胞因子的上调和炎症细胞因子的下调，诱导原始T细胞和效应T细胞的耐受表型，抑制B细胞产生抗体，抑制NK细胞增殖和NK细胞介导的细胞毒性。MSCs在单倍体造血干细胞移植中具有很高的应用前景，相比于骨髓MSCs，UC-MSCs体外增殖更快，更易获得，免疫原性更低且具有更强的免疫抑制作用[13-16]。本中心前期将UC-MSCs应用于接受MSD/MUD HSCT的SAA患者，验证了其疗效及安全性[23-24]，因此自2016年以来开始探索将UC-MSCs应用于接受HID-HSCT的RSAA患者。

植入失败是Allo-HSCT的严重并发症，非恶性血液病患者的发生率比恶性血液病患者高3倍[25]，相比同胞全相合Allo-HSCT，接受无关供者移植及亲缘单倍体移植的SAA患者更容易发生植入失败。在动物模型中，MSCs与造血干细胞的共同移植改善了移植效果，因此研究者推测MSCs有助于造血干细胞植入[26-27]。Noort等[26]研究证明在非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠中，MSCs和CD34+细胞共同输注可促进人造血干细胞植入。Ding等[28]采用单倍型造血干细胞与UC-MSCs共输注治疗25例成人SAA患者，粒系及巨核系中位植入时间分别为16.12和28.30 d。本研究中18例患者粒系及巨核系植入中位时间分别为13(11～23)d、14(12～26)d，仅1例患者于巨核系植入前因颅内出血死亡，粒系累积植入率为100.00%，巨核系累积植入率为94.40%。

GVHD是SAA在HID-HSCT中的另一个重大挑战，研究报道不同移植体系进行HID-HSCT时aGVHD的发病率(Ⅱ级)为12%～42%，cGVHD为20%～56%[29-31]。Xu等[9]进行的一项前瞻性多中心研究纳入了101例接受Haplo-HSCT的难治性SAA患者，中位随访时间为18.3个月，Ⅱ～Ⅳ级aGVHD发生率为33.7%，cGVHD发生率为22.4%，3 a总生存率为89.0%。一项52例儿童SAA患者接受Haplo-HSCT治疗的研究中，Ⅱ～Ⅳ级和Ⅲ～Ⅳ级aGVHD的累积发生率分别为(39.2±0.5)%和(13.7±0.2)%，cGVHD的累积发生率为(34.2±0.5)%，中位随访时间744.5个月，3 a总生存率和无失败生存率分别为(84.5±5.0)%和(82.7±5.2)%[32]。

MSCs具有免疫调节特性，可能调节针对同种异体抗原的免疫反应，对GVHD的预防或治疗可能是安全有效的[33-35]。Wu等[36]将培养扩增的第三方供体UC-MSCs共同移植到21例接受Haplo-HSCT的SAA患者中，Ⅱ～Ⅳ级aGVHD和cGVHD的发生率分别为42.8%和50.0%，2 a无疾病生存率为74.1%。一项多中心Ⅱ期研究纳入了44例SAA患者接受MSC联合haplo-HSCT，41例患者可评估，中位随访时间12个月，Ⅱ～Ⅳ级aGVHD(29.3%)和cGVHD(14.6%)的发病率较低，总生存率为77.3%[8]。近期一项meta分析也表明，MSC输注降低了cGVHD的发病率[35]。本研究中18例患者Ⅰ/Ⅱ度急性GVHD、Ⅲ度急性GVHD、慢性GVHD发生率分别为38.89%(7/18)、5.56%(1/18)、23.53%(4/17)，重度aGVHD及cGVHD发生率均较低。中位随访时间32.97(1.60～63.67)个月，3 a总生存率为(83.3±8.8)%，15例存活患者均脱离输血依赖，血象恢复正常，生活质量良好，对于RSAA患者而言，疗效令人满意。

CMV、EBV感染是allo-HSCT后的常见并发症，是引起移植后非复发死亡的重要危险因素。移植后早期免疫重建不佳可能是患者移植后PTLD及CMV感染率高的危险因素[37]。鉴于MSCs非特异性免疫抑制的特点，对MSCs是否增加患者感染风险仍存在争论。Karlsson等[38]发现，MSCs对病毒诱导的T细胞反应无明显抑制作用，EBV特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)或与BM-MSCs培养的CMV特异性CTL保留增殖和产生干扰素的能力，在体外对病毒抗原作出反应并杀死病毒感染的细胞。Xu等[9]报道接受HID-HSCT的SAA患者CMV、EBV再激活率分别为68.3%、17.8%。本研究中18例患者中仅6例(33.30%)移植后出现CMV再激活，且无CMV病发生。EBV再激活发生率较高(44.40%)，但多数为自限性，仅1例发生PTLD，且该患者病史长达10余年，长期应用免疫抑制药物，基础条件较差，移植后免疫重建延迟。

此回顾性研究证实UC-MSCs在RSAA患者HID-HSCT中的应用安全可行，可能有效提高植入率，降低重度GVHD和cGVHD的发生率。但本研究样本量少，仍需大样本量、随机双盲对照临床试验，以证实联合MSCs在单倍型HSCT治疗SAA患者的疗效及安全性。