男性HBV感染及不同标志物模式对常规精液参数和精浆生化指标的影响

孙向茹，蔡炳，张丽丽，刘蔚菁，刘海鹏，刘奇志

1.广州市番禺区妇幼保健院生殖医学科，广东 广州 511400；2.中山大学附属第一医院生殖医学中心，广东 广州 510080

不育症影响着全球大约1/6的夫妇，其中因男性因素引起的不孕约占50%，且男性不孕患者逐年增多[1]。精索静脉曲张、隐睾症、性腺机能减退、遗传因素及病毒感染均可能导致男性不育，尤其是病毒感染对男性生育力的影响越来越引起学者的关注。我国是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的高发区。相关研究发现，HBV作为非单一的嗜肝病毒，不仅可以感染肝细胞导致慢性肝炎、肝硬化及肝癌等相关疾病，而且可以通过血-睾屏障进入男性生殖系统，进而整合到人类精子细胞的染色体上[2-3]。因此，研究HBV感染与男性生殖的关系是生殖医学领域的重要问题之一。目前，关于HBV感染是否影响精液质量、降低男性生育力还存在争议[4-6]。既往的研究依赖的评价指标主要是精子浓度、活力和正常精子形态等常规精液参数，由于HBV与男性生殖系统的交互作用存在于分子级别，导致常规精液参数评价存在一定的局限性。研究发现，常规精液参数正常的不育患者，在体外授精(in vitrofertilization，IVF)治疗中也会发生受精率低下或完全不受精[7]。精浆生化参数是近年来发现的描述精子功能和受精能力等方面的指标，也逐渐成为精液质量和男性生育力评估的重要内容，但是，目前有关HBV感染对精浆生化指标影响的研究较少，尚不能全面评估HBV感染对精液质量及男性生育力的影响。此外，由于HBV感染人体后机体的免疫反应是不同的，导致人群中HBV感染的血清学模式也是多种多样的，因此，不同HBV标志物模式对男性精液质量的影响是否存在差异是本文的研究重点。本研究旨在探讨男性HBV感染及不同标志物模式对精液常规参数及精浆生化指标的影响，为评估HBV感染对精液质量及男性生育力的影响提供更加全面的证据支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2021年6月在广州市番禺区妇幼保健院生殖医学科接受第一次宫腔内人工授精(intrauterineinsemination，IUI)治疗的557例男性患者为研究对象。纳入标准：(1)无明显影响精液质量的疾病、遗传因素及生活习惯；(2)肝功能正常；(3)除HBV外，无其他细菌或病毒感染。排除标准：(1)精索静脉曲张、隐睾症、性腺机能减退及男性遗传因素；(2)肝功能异常；(3)酗酒；(4)其他急、慢性传染性疾病(如丙型肝炎、艾滋病及梅毒)；(5)支原体、衣原体感染。根据男方血清乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是否阳性分为HBV感染组和未感染组。再根据男方乙肝病毒五项分为不同标志物模式组，乙肝五项均为阴性或仅HbsAb阳性设为对照组，选取病例数大于10例的乙肝标志模式组与对照组进行比较。本研究经过医院伦理委员会的批准。

1.2 研究方法

1.2.1 一般临床资料收集 回顾性收集患者的年龄、身体质量指数(body mass index，BMI)、肝功能检测、饮酒史、传染性疾病和感染性疾病等一般临床资料。

1.2.2 实验室指标检测

1.2.2.1 乙肝病毒五项检测 通过中山生物公司试剂盒使用酶联免疫吸附法检测乙肝病毒五项(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb)。

1.2.2.2 精液常规参数检测 禁欲3～7 d，手淫法取精后放37℃恒温箱内液化。严格按照世界卫生组织(WHO)《人类精液检查与处理实验室手册》第5版要求进行检测。精液体积采用称重法，精子浓度及活力检测采用计算机辅助精子质量分析系统(computer assisted sperm analysis，CASA)分析精液。精子形态学分析用Diff-Quik快速染色法，以正常形态百分率4%作为参考值下限。所有技术人员均进行规范化培训并通过考核，并在本省组织的男科实验室室间质评中各项检测结果均在控。

1.2.2.3 精浆生化指标检测 精子顶体酶活性和精浆锌含量检测按照南京欣迪生物药业工程有限公司提供的试剂盒的检查方法，顶体酶活性检测采用改良Kennedy法，精浆锌含量检测采用化学比色法。中性α-葡糖苷酶含量检测采用深圳华康生物医学工程有限公司提供的检测试剂盒(改良PAR法)。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行数据统计分析。计量资料不符合正态分布和方差齐，采用M(P25，P75)表示，组间比较采用Kruskal-WallisH检验，两两比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以例或例(%)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般情况 557例男性患者中HBsAg阳性105例，HBsAg阴性452例。根据乙肝病毒五项检测结果共有12种乙肝标志物模式，构成比中比例较高的模式依次为模式3、6和4；HBsAg阳性的感染模式有4种：模式1(小三阳)、2(大三阳)、7和11；除对照组外(模式3和4)，病例数大于10例的标志物模式有7种，见表1。

表1 557例IUI人群中男性HBV感染标志物模式流行病学情况Table 1 Epidemiology of HBV infection in 557 males following IUI treatment

2.2 HBV感染对精液常规参数和精浆生化指标的影响 感染组和未感染组间的男方年龄和BMI指数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。两组间的精液量、精子浓度、前向运动精子百分率、前向运动精子总数和正常精子形态百分率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。精浆生化指标中，感染组的精浆锌含量和顶体酶活性明显低于未感染组，差异均有统计学意义(P<0.05)；而两组间的中性α-葡糖苷酶含量比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 HBV感染组与未感染组精液常规参数和精浆生化指标比较[M(P25，P75)]Table2 Comparison on standard sperm parametersand seminal plasma biochemical parametersof maleswith and without HBV infection[M(P25,P75)]

2.3 不同标志物模式对精液常规参数和精浆生化指标的影响 基础参数中，模式1组、5组和6组的男方年龄高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而各模式组的男性BMI指数和对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。常规精液参数中，模式6和9组间的精子浓度高于对照组，模式2组和9组间的前向运动精子总数高于对照组，模式7组的精子正常形态百分率高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；而其余参数与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。精浆生化指标中，模式1组(小三阳)和2组(大三阳)的精浆锌含量明显低于对照组，而模式5组的精浆锌含量明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；模式1组、2组和7组间的顶体酶活性与对照组比较有降低趋势，但是均没有达到统计学意义(P>0.05)；所有标志物模式组的中性α-葡糖苷酶含量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 不同HBV感染标志物模式组与对照组精液常规参数和精浆生化指标比较[M(P25，P75)]Table 3 Comparison on standard sperm parameters and seminal plasma biochemical parameters of males with different HBV serostatus and their controls[M(P25,P75)]

3 讨论

精液常规检测是男性生育力初步评估的实验室基础项目，精子浓度和精子总数等指标反映精子的生成状态，精子活力及前向运动率反映精子的运动能力，这些常规参数意义重大，但均存在波动性大、稳定性差、主观性强等缺点。而基于化学比色法的精浆生化参数分析在精子功能和受精能力等方面提供了更加全面的信息，且更为客观和稳定，其中顶体酶活性、精浆锌和中性α-葡糖苷酶是较为重要且临床应用比较广泛的精浆生化指标。精液常规检查联合精浆生化分析有助于对男性生育力进行全面而精确的诊断及预后评估。我国HBV感染率约为10%，HBV感染对男性精液质量及生育力的影响受到学者的关注。本研究在接受IUI治疗的男性中发现了12种乙肝标志物模式，通过分析HBV感染及不同标志物模式对精液常规参数和精浆生化指标的影响，全面而客观地评估了HBV感染对男性精液质量的影响。

一些研究者认为男性HBV感染者的精子浓度、活力和正常精子形态百分率低于未感染者[4-5，8-9]，另一些研究者认为HBV感染者与未感染者的精液常规参数比较无统计学差异[6,10]。由此可见，目前关于HBV感染是否影响精液常规参数还存在一定争议。本研究结果显示，接受IUI治疗的夫妇中男性HBsAg阳性率为18.85%，高于我国平均感染水平，提示HBV感染可能与男性生育力降低有关；但是，HBV感染组与未感染组的精液量、精子浓度、活力和正常精子形态百分率等常规参数比较均无统计学差异，提示HBV感染没有对精液常规参数产生明显不利的影响。此外，本研究将12种乙肝标志物模式中病例数大于10例的7个模式组与对照组进行比较发现，HBsAg-的标志物模式中模式6组和9组间的精子浓度高于对照组，模式9组的前向运动精子总数高于对照组；HBsAg+的标志物模式中模式2组(大三阳)的前向运动精子总数高于对照组，模式7组的精子正常形态百分率高于对照组，而模式1组(小三阳组)的精液常规参数与对照组比较差异无统计学意义，提示HBV不同标志物模式组间的精液常规参数存在一定的差异，但是各标志物模式(即使是HBsAg+的标志物模式)均未对精液常规参数产生不利影响。与本研究结果不同，温子娜等[11]在研究HBV不同感染状态对精液质量的影响中发现，男方大三阳组和小三阳组的精液常规参数低于未感染对照组。可能原因是：人群差异；精液常规参数本身易受多种因素的影响，波动性大，重复性差。

顶体是由精子细胞核附近的高尔基复合体形成，为精卵结合提供条件，内含多种水解酶，其中顶体酶是顶体反应中最为重要的一种酶。顶体酶活性是判断精子穿透卵子透明带能力的重要指标之一，是预测男性精子受精能力的重要生化指标。郭丽媛等[12]通过检测214例不明原因不育男性的顶体酶活性，发现56例精子顶体酶活性存在异常。冯星等[13]在研究不同参数精子的顶体酶活性与IVF治疗中受精能力的关系时发现，顶体酶活性正常值组的精子浓度高于顶体酶活性低值组，且前者IVF受精率高于后者。提示精子顶体酶活性在男性生育能力评估和男性不育症诊治方面具有重要的临床意义。本研究结果显示，HBV感染组的精子顶体酶活性低于未感染组，提示HBV感染对男性精液质量产生了不利影响。此外，HBsAg+的标志物模式1组(小三阳)、2组(大三阳)和7组间的精子顶体酶活性与对照组比较有降低趋势，但是均没有达到统计学差异，这可能与这些标志物模式组的样本量小有关。相关研究认为顶体酶活性与精子正常形态率呈正相关，精子形态学畸形率高会影响顶体酶活性并导致受精能力下降[14]。本研究结果显示，HBV感染组的精子顶体酶活性降低，但是精子正常形态百分率与未感染组比较无统计学差异。可能原因是：大多数实验室的精子形态学分析的染色和读片都由人工完成，人为影响因素较多；形态学上的细微差异很难通过人眼来识别。这也正是精浆生化分析更为客观而稳定的优势所在。

随着男性不育患者的逐年增多，精浆中的锌含量与男性不育的关系成为研究热点。相关研究表明，精浆中的锌可能通过影响垂体分泌促性腺激素及睾丸生精功能来调节精子的产生和运动；另外，锌直接参与精子的生成、成熟和获能的过程，还可保护精子膜，对精子的运动性和功能都有着重要作用。多项研究表明精浆锌含量降低会对精液质量产生不利的影响[15-17]，但是目前国内外关于HBV感染对精浆锌含量的影响还未见报道。本研究结果显示，HBV感染组的精浆锌含量明显低于未感染组；不同标志物模式组中HBsAg+的标志物模式1组(小三阳)、2组(大三阳)和7组的精浆锌含量与对照组比较有降低趋势，但只有模式1组(小三阳)和2组(大三阳)低于对照组有统计学差异，提示HBV感染虽然没有对精液常规参数(如精子浓度和活力)产生明显不利的影响，但是HBV感染(特别是大三阳和小三阳感染模式)影响精浆中的锌含量，可能对男性生育产生不利的影响。

目前，HBV感染影响精液质量的具体机制还不清楚。研究发现HBV能够增加氧化应激丙二醛的含量以及诱导白细胞介素-17和白细胞介素-18的异常表达，降低精子的抗氧化能力，导致精子功能障碍；HBV感染还会导致精子细胞膜的通透性增加，破坏精子运动所必需的细胞内离子浓度，导致精子凋亡[18-20]。此外，HBV进入到生殖系统中可能与血-睾屏障的损伤有关，且HBV感染可能会造成机体免疫功能的紊乱，这是否与精浆生化指标(顶体酶活性和锌含量)降低有关还未可知，但本研究的相关结果为进一步研究HBV感染影响精液质量的具体机制提供了一个新的方向。

综上所述，男性HBV感染及不同标志物模式对精液常规参数未产生不利影响，但是HBV感染者的精子顶体酶活性和精浆锌含量降低，尤其是HBV“小三阳”和“大三阳”感染模式者的精浆锌含量明显受到影响，可能对男性生育产生不利影响。