中药干预Hippo通路抗肾纤维化的研究进展*

樊尚珩 李 均

遵义医科大学珠海校区,广东省珠海市 519000

肾脏纤维化(renal fibrosis)是慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)发展的病理基础,其病变包括上皮受损激活炎症反应,持续的炎症损伤导致肾脏内环境抗损伤修复系统失调,诱导肌成纤维细胞过度增殖转化,基质金属蛋白酶(MMPs)/基质金属酶组织抑制因子(TIMPs)失衡致大量细胞外基质(ECM)过度沉积,引起肾小管萎缩、肾小管组织结构的永久性破坏,最终细胞凋亡器官功能丧失[1-2]。随着肾脏纤维化的进行性发展,无法避免危及至人体其他系统功能,引发一系列并发症最终导致死亡。越来越多的研究证实河马—萨尔瓦多通路(Hippo信号通路)对肾纤维化的发展发挥着重要作用。Hippo通路关键核效因子YAP/TAZ持续激活诱导下游致纤维化靶基因过度表达致组织损伤修复不良和纤维化[3]。长期以来,使用中药治疗肾纤维化具有独特的优势和应用前景。基于中药整体疗效应且通过多靶点、多机制抑制肾纤维化,将中药应用于抗肾纤维化的研究获得越来越多的关注。使用中药干预Hippo通路防治肾纤维化也取得了一定的研究成果。本文就Hippo信号通路对肾纤维化的作用以及近年来中医药靶向Hippo信号通路治疗肾纤维化的相关研究进展予以简要综述,为寻找潜在的治疗靶点及后续相关研究提供新思路。

1 Hippo信号通路与肾纤维化

1.1 Hippo信号通路构成 Hippo途径是一条由一系列蛋白激酶和转录因子组成的信号传导链。哺乳动物Hippo通路由三个激酶级联组成：哺乳动物不育20样激酶1/2(MST1/2)、大肿瘤抑制因子1/2(LAST1/2)、下游重要效应因子yes相关蛋白(YAP)和带有pdz结合基序的转录共激活因子(TAZ)[4]。MST1/2和LAST1/2是该途径上游信号的核心组成部分, 而YAP、TAZ是Hippo信号通路下游众多靶基因的转录辅助激活因子,其中TEADs是主要的YAP下游转录因子[5]。生理状态下通路的激活可被看成一条线性级联,Hippo通路的激活源于MST1磷酸化,磷酸化的MST1与Salvador(SAV1)结合形成MST-SAV复合体,其直接磷酸化LAST1/2,活化的LAST1/2磷酸化YAP中的丝氨酸残基,导致YAP与支架蛋白14-3-3结合后阻碍YAP由细胞质转移到细胞核的途径,使YAP滞留在细胞质中泛素化、降解;位于细胞质中的YAP不能与核内TEAD结合,从而抑制了YAP转录活性,使细胞增殖和器官生长受到限制[6]。当该途径上级效应因子受外界不良环境影响而发生突变、缺失而出现畸变,导致上游MST1/2、LATS1/2激酶级联被抑制,去磷酸化的YAP由细胞质转移至细胞核内积聚;为诱导下游靶基因的表达,移位至核内的YAP本身不与DNA结合,而与转录因子TEA结构域家族成员蛋白形成复合体诱导下级靶基因表达,如CTGF、EGFR、TNF-α,从而激活细胞增殖[7]。

1.2 Hippo信号通路对肾纤维化的影响

1.2.1 Hippo信号通路调控炎症反应：在器官纤维化中,炎症导致氧化应激诱导TGF-β产生和上皮—间充质转变样表型(EMT),上调YAP/TAZ蛋白表达,并触发炎症信号NF-κB途径促进炎症反应进一步加重并导致促纤维化进展的一系列细胞机制使组织硬度增加[8]。周细胞存在于大血管和毛细血管的壁上,它积极参与血栓形成和新生血管的炎症反应。当血管内皮细胞受损时,周细胞表达的组织因子促进血小板聚集并释放促炎因子[9]。Yang等[10]通过YAP基因敲除(YAP-SiRNA)抑制了周细胞、内皮细胞炎症反应,观察到对下游炎症因子JNK、NF-κB和TNF-α的抑制作用。提示YAP/TAZ激活参与了周细胞炎症反应的启动,并证实了YAP/TAZ是所有炎症因子的上游基因。此外,Zheng等[11]使用肾缺血/再灌注诱导小鼠AKI-CKD转变模型发现肾脏不良修复、巨噬细胞浸润和MCP-1过表达与YAP持续激活有关,且使用YAP抑制剂维替泊芬(VP)可抑制上述改变。

1.2.2 Hippo信号通路参与EMT：Seo等[12]在肾小管上皮细胞特异性缺失Sav1基因的单侧输尿管梗阻模型诱导小鼠中发现肾脏纤维化加重,上皮—间充质转变样表型改变,EMT标志物如α-SMA、波形蛋白、成纤维细胞特异性蛋白-1、上皮细胞标志物E-cadherin等表达增加,细胞凋亡和不良增殖。Xu等[13]使用突变小鼠研究发现特异性敲除MST1、MST2可使YAP/TAZ在组织中表达增加,导致纤维相关因子纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白等表达增加。与之对比,选择性敲除YAP表达可显著减轻肾功能下降,并降低纤维化因子TGF-β和CTGF的表达[14]。此外,MST1/2的缺失可诱导炎症细胞因子TNF-α表达增加,且TNF-α通过正反馈回路激活YAP,最终突变小鼠肾脏出现进行性炎症、肾脏组织结构损伤导致纤维化和功能损害[15]。

1.2.3 Hippo通路参与机械转化及与其他信号通路的串扰：YAP/TAZ可感应细胞微环境如细胞外基质硬度、细胞密度和细胞骨架张力等变化,即通过机械转导感知器官物理环境,将机械力和变形转化为生化信号,影响基因表达、细胞形状和细胞命运[16]。Jin等[17]在单侧输尿管梗阻小鼠模型中发现肾缺血性损伤引起的炎症反应促进肾实质ECM沉积,ECM的过度积累驱动进行性器官纤维化,增加组织硬度,激活机械敏感的“物理传感器”YAP。活跃的YAP上调ECM沉积并激活正反馈回路,诱导成纤维细胞激活加重肾纤维化。TGF-β信号转导在肾间质纤维化的发生发展中起重要作用,包括Smad依赖和非Smad依赖途径。Szeto等[18]的研究表明肾脏硬化后,在坚硬的基质中YAP/TAZ通过将激活的Smad2/3保留在细胞核中来促进TGF-β信号转导,首次证明了TGF-β诱导的典型Smad2/3信号是通过ECM刚性变化控制Smad2/3的定位来调节的,并且这种机制的调节可能依赖于蛋白Yap和TAZ。YAP/TAZ通过机械调节TGF-β/Smad信号通路促进UUO小鼠肾纤维化,从而导致成纤维细胞转化和ECM的产生。

2 肾纤维化在中医领域的认知

肾纤维化是西医病理名词,中医古籍中无此定义,根据其各种病理与临床表现,包括“水肿”“关格”“癃闭”“虚劳”“肾劳”“肾风”“溺毒”“腰痛”“尿浊”等病证范畴。其病因病机可总概括为“本虚标实”,本虚为脾肾两脏的气血阴阳亏虚为疾病发病之本,以外邪、湿浊、湿热、水饮、瘀血、浊毒等为标,尤其以瘀血贯穿于慢性肾脏病至纤维化的始终[19]。“痰”“浊”“瘀”“毒”既是病理产物又是致病因素,与“本虚”相互作用,互为因果。综上所述,RIF发展涉及多种病机,因此治疗上当以活血化瘀、补虚培本、益肾健脾、排浊解毒、清热利湿为法。相较于西药作用靶点单一,中医药注重整体观念和人的整体功能,考虑疾病的综合因素以及脏腑之间的关系。通过充分认识肾纤维化的病机及中医药发挥的功效有助于创造更多更优的治疗选择。

3 中药调控Hippo信号通路干预肾纤维化的相关研究

3.1 单味中药

3.1.1 祛湿类：雷公藤作为一类祛风通络、除湿止痛的中药,临床上常用来治疗肾脏疾病、风湿免疫类疾病等,可通过调节NF-κB、Wnt/β-catenin、TGF-β等多条信号通路发挥抗炎、抗氧化、抗纤维化等作用。臧勇等[20]使用致纤维化因子TGF-β诱导HK-2细胞发生EMT变化,产生纤维化现象。同时发现使用TGF-β诱导的HK-2细胞中TAZ蛋白表达量相较于TGF-β与TP共同诱导的HK-2细胞TAZ蛋白表达量显著升高,提示TP可通过调节Hippo通路效应因子表达抑制肾小管上皮细胞纤维化。

桑枝作为药食兼用植物是一味传统中药材,其是桑科植物的干燥枝条,性平味苦,入肝、脾、肺、肾经,具有祛风活络、利关节和燥湿利水等疗效,临床上可用于治疗关节肿痛、手足麻木、风湿痈痛等疾病。余文胜等[21]对糖尿病db/db小鼠模型使用不同剂量桑枝多糖进行干预发现,桑枝多糖高剂量组(1 200mg/kg)小鼠肾功能、肾脏组织纤维化因子、炎症因子以及YAP、TAZ蛋白表达量明显低于桑枝多糖低剂量组(600mg/kg),且桑枝多糖低剂量组肾功能及肾脏病理变化较模型组明显改善。以此提示桑枝多糖可能通过调节肾脏组织YAP、TAZ蛋白表达以及抑制YAP/TAZ信号通路下游的效应因子生成减缓肾间质纤维化的形成从而发挥抗纤维化作用。

3.1.2 活血类：姜黄素是一种姜黄属根茎提取物,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、调脂降糖等生物学活性[22]。严颖等[23]运用改良的5/6肾结扎方式诱导CKD模型观察肾纤维化病理、肾功能及纤维化指标α-SMA的表达量增加,而使用姜黄素100mg/kg的含药饲料治疗3个月后发现可以显著减缓CKD进程,减慢肾纤维化进展,有利于肾功能恢复,且姜黄素治疗组肾组织YAP蛋白表达量较结扎组显著下降。

3.1.3 槲皮素：槲皮素属于天然黄酮类物质,具有抗炎、抗氧化、抗菌等多种生物活性,且已有研究报道槲皮素具有缓解肾纤维化的作用[24]。Du等[25]证实了Hippo通路参与了高糖 (HG) 诱导的肾小球系膜细胞(MCs)的增殖,促进系膜基质和ECM的合成、沉积增加,导致肾小球硬化。研究发现槲皮素呈剂量依赖性方式逆转HG诱导的MCs中降低的磷酸化MST1和LATS1,使用槲皮素逆转HG诱导的YAP-TEAD结合,减少YAP的核表达。总之,槲皮素可以通过重新激活糖尿病小鼠的Hippo 通路来抑制 MCs 的增殖,并减轻糖尿病小鼠的肾间质纤维化。

3.2 中药复方

3.2.1 黄芪三七合剂：黄芪三七合剂为临床上长期用于治疗慢性肾病的复方制剂,对肾功能能受损有明显改善作用。该方主要由黄芪、三七、昆布、怀牛膝等组成,对糖尿病肾病、急性肾损伤炎症发展有一定改善作用[26]。雷小琴等[27]使用黄芪三七合剂对AKI小鼠(86.746mg/只)连续灌胃3d,发现治疗组NF-κB p65及相关炎症因子、YAP蛋白水平量较模型组降低。因此认为黄芪三七合剂改善小鼠急性肾损伤可能与YAP/NF-κB信号轴有关。

3.2.2 虫草益肾方：虫草益肾方是宋立群教授治疗CKD的经验方。全方以冬虫夏草为君药,以改善脾肾脏腑虚损之本;黄芪为臣药,益气健脾,补后天以养先天。全方兼健脾益肾、活血化瘀、泻浊解毒之效。苑伯菲等[28]观察到UUO大鼠模型中虫草益肾方组肾功能指标、组织纤维化面积较模型组减少,磷酸化MST1、LATS1、YAP蛋白表达量较模型组上调。因此考虑虫草益肾方保护UUO大鼠肾功能、抑制EMT、延缓RIF进展,其机制可能与调控Hippo信号通路中核心蛋白YAP、Mst1、Lats1蛋白磷酸化表达程度相关。

4 展望

肾纤维化病理机制复杂,涉及多条信号转导途径相互作用。近年更多的研究显示Hippo信号通路在肾纤维化中发挥重要作用,涉及细胞凋亡、氧化应激、炎症损伤、EMT、ECM合成及沉积等多种机制。鉴于中药的多靶点治疗效应,且中药治疗肾纤维化的疗效明确。现已有相关研究表明中药靶向调控Hippo信号通路的各级激酶蛋白及下级效应因子表达达到抗肾纤维化作用。尽管中药干预Hippo信号通路延缓肾纤维化的研究取得了一定的成果,但目前的研究现状仍有不足：第一,中医药种类繁多,单味中药及复方其有效成分、药理作用复杂,但真正发挥疗效的组分提取、剂量,不同有效组分剂量配伍仍有待深入研究;第二,目前很多研究限于基础实验和动物实验,于临床应用仍有一定差距,中药发挥作用机制复杂,未来仍需进一步研究以得到现代医学的接受;第三,在已有的中药干预Hippo信号通路抗肾纤维化研究中,大部分为祛湿类、清热类、活血类,那么属于以上类别的其他中药是否也具有相似的抗肾纤维化机制,在未来研究类别相同的中药可否通过Hippo通路抗肾纤维化值得我们进一步实践。总之,依据目前已有的Hippo通路在肾纤维化中的作用及中药干预实验,未来仍需更深入的研究中医药防治肾纤维化的潜在机制并将其应用在临床工作中,并逐渐完善中药有效组分之间的配伍—剂量关系,“精准配伍”有利于提高主效应,减少毒副反应,为延缓肾纤维化提供理论参考和药物策略。