乳酸菌和糖蜜对构树叶青贮品质和细菌多样性的影响

孙 蓉，刘 悦，陈 婷，吕仁龙，周汉林，李 茂*，字学娟*

(1.海南大学林学院，海南 儋州 571737；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737；3.中国热带农业科学院湛江试验站，广东 湛江, 524000)

近年来我国畜牧业发展迅速，饲料需求增大，饲料供给不足限制了畜牧业的发展，因此，开发新的饲料资源十分必要[1]。构树(Broussonetiapapyrifera)，广泛分布在我国温带、热带地区，具有生物量大、生长快、适应性强等特点[2]。构树嫩枝叶营养价值高，可作为新型的饲料资源，开发构树饲料有利于缓解我国饲料短缺问题。但构树含有单宁等抗营养因子，影响动物适口性和营养物质消化吸收，研究表明对构树叶进行青贮处理，可以提高构树叶适口性和饲用价值[3]。然而构树叶本身附着的乳酸菌很少，且粗蛋白高，含糖低，难以调制优质青贮饲料，为了改善构树青贮发酵品质和提高其营养价值，可在青贮时添加糖蜜和乳酸菌[4-5]。外源乳酸菌的加入有利于快速产生乳酸，降低pH值抑制不良微生物生长，促进乳酸发酵，使原料得以长期保存[4-6]。糖蜜主要成分是蔗糖，常被用来当作乳酸菌的发酵底物应用于饲草青贮调制[6]。糖蜜可促进青贮发酵使饲料中的乳酸菌产乳酸从而降低pH值，并抑制丁酸产生和防止原料蛋白水解，进而提高青贮发酵品质[7]。糖蜜和乳酸菌在构树青贮中应用已有报道，对改善发酵品质和提高饲用品质均具有积极作用[3-5]。但关于构树青贮微生物多样性的研究报道较少，糖蜜和乳酸菌对构树青贮微生物组成的影响尚不明确。为保证构树青贮发酵品质，深入了解青贮细菌的组成和丰度亦非常必要。因此，本研究采用16S高通量测序技术研究添加糖蜜、乳酸菌对构树叶青贮细菌群落组成影响，为构树叶青贮饲料的加工调制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

构树于2019年6月从海南省儋州市中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所畜牧基地采集，构树嫩茎叶在采摘后用电动铡草机切碎至2～3 cm，再进行3.5小时的晾晒处理后备用。乳酸菌添加剂为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，活菌数≥1×1010cfu·g-1，由日本国际农林水产研究中心蔡义民研究员提供)，糖蜜为工业废弃物。

1.2 试验设计

实验共有四个处理组，直接青贮为CK组、糖蜜为M组(2%，FM)、乳酸菌为L组(1×106cfu·g-1，FM)、糖蜜和乳酸菌混合添加为ML组(添加量同上)，每组3个重复，构树叶和添加剂充分混匀后装入专用塑料青贮袋中，抽真空后室温存放30天后，打开青贮袋，取样分析各项指标。

1.3 测定指标及方法

1.3.1营养成分测定 取青贮材料200 g左右放置于信封内，将其放入105℃干燥箱中20 min左右，最后再放入65℃的烘箱中烘48个小时，烘干多余的水分至恒重，待自然冷却后进行磨粉装样，用作营养成分测定。

1.3.2发酵品质测定 青贮后开封，称取50 g混合均匀的构树叶青贮料，放入烧杯中，并加入200 mL蒸馏水置于4℃冰箱内浸取24小时，拿出烧杯对浸液进行过滤，滤液装入塑料管中盖紧，放入离心机离心后取出，一部分用于测定青贮发酵指标，另一部份放入-80℃液氮保存用于微生物多样性分析[8]。其中pH值用pH计测仪进行测定，乳酸、乙酸、丙酸、丁酸按照Li等[9]方法进行测定。

1.3.3微生物多样性分析测定 本研究中青贮微生物测序及分析由北京百迈客生物科技有限公司协助完成。将上述每一组的三个重复样本均匀混合后经过处理提取样本DNA，PCR扩增选用细菌16S rRNA(V3+V4)区域通用引物，具体序列为5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，5′-GGACTAC-HVGGGTWTCTAAT-3′，再通过高通测序技术的双末端测序方法，构建片段文库进行测序，微生物测序是基于Illumina HiSeq测序平台，采用双末端测序(Paired-End)，构建小片段文库进行测序，并对结果进行分析，包括Alpha多样性指数(Ace指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数)、beta多样性分析、微生物区系结构分析[8-10]。

1.4 数据处理

青贮微生物生物信息分析和作图在百迈客云平台(www.biocloud.net)完成。青贮发酵指标采用Excel 2003对数据进行整理，并采用SAS 9.3软件包进行统计分析，结果用“平均值±标准差”表示，用Duncan法对各测定数据进行多重比较分析，P<0.05表差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同添加剂对构树叶青贮饲料发酵品质的影响

由表1可知，糖蜜的使用能降低构树叶青贮的pH值(P<0.05)，糖蜜与乳酸菌混合使用降低pH值的效果低于单独使用糖蜜；与CK相比，添加处理均能显著提高构树青贮饲料乳酸含量(P<0.05)；所有添加处理组的乙酸(P<0.05)、丙酸含量均降低，其中，M组的丙酸含量下降较明显(P<0.05)，本研究中，所有添加处理组均未检出丁酸。综上，添加糖蜜及糖蜜、乳酸菌混合的构树叶青贮效果优于直接青贮，亦优于乳酸菌单独添加处理。其中，单独添加糖蜜的青贮饲料发酵效果最好。

表1 构树叶青贮发酵品质

2.2 构树青贮α多样性分析

构树叶青贮细菌多样性如表2所示，Shannon指数值越大表明微生物多样性越高，M组的微生物多样性最高，其次是ML组，CK组和L组最低且相同。Simpson指数值越小表明菌群丰度越高，菌群丰度从高到底依次为M组、ML组、CK组、L组。与对照组(CK)相比，乳酸菌(L)的添加使构树叶青贮的细菌环境菌群丰度降低。糖蜜(M)及糖蜜、乳酸菌混合(ML)的添加，使构树叶青贮细菌多样性及丰度提高。

表2 构树叶青贮α多样性指数

如图1所示，构树叶青贮的OTU聚类分析共有111个不同的OTU被检测到，从OTU贡献数量来看，糖蜜、乳酸菌混合(ML)组的OTU数量最高，有109个，糖蜜(M)组的OTU数量107个，对照组(CK)组的OTU数量为106，乳酸菌(L)组的OTU数量为105个，说明ML组的细菌种类丰度最高。同时对四个处理组做OTU韦恩图进行比较，发现四个处理组共享的OTU为101个，对照组(CK)和乳酸菌(L)组特有的OTU为0，糖蜜(M)组特有的OTU为1个，糖蜜和乳酸菌混合(ML)组特有的OTU为2个，说明M组和ML组均产生独特的群落差异。

图1 构树叶青贮细菌群落OTU分析和韦恩图

2.3 β多样性分析

通过PCA分析不同处理OTU组成反映样本间的差异，不同色点代表不同处理，不同色点之间的距离越近，表明不同处理之间细菌群落结构的相似性越高。由图2可知，PC1成分的贡献率为89.49%，PC2成分的贡献率为3.53%。M组点与其他组距离较远，说明其菌群结构组成与其他三组差异较大。CK与L组相对较靠近，表明两组之间细菌群落结构比较相似。ML较为分散，其中有两点距离其他组均较远，说明ML组与其他三组的细菌群落结构也存在明显差异。

图2 构树叶青贮β多样性分析

2.4 构树叶细菌群落结构分析

如图3(A)所示，构树叶青贮饲料细菌群落结构中，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为四个处理组的优势菌门。其中厚壁菌门相对丰度最高是M组(68%)，接着是CK组(53%)、ML组(46%)、L组(44%)，变形菌门相对丰度由高到低依次为L组(51%)、ML组(47%)、CK组(42%)、M组(29%)。其他菌门包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和放线菌门(Actinobacteria)，其相对丰度在四个处理组中均不足7%。M组厚壁菌优势明显说明在构树叶青贮中，添加糖蜜可以增加厚壁菌门相对丰度，降低变形菌门相对丰度。

如图3(B)所示，CK组的优势菌为魏斯氏菌属(Weissella)、乳杆菌属(Lactobacillus)和肠杆菌属(Enterobacter)，相对丰度分为34%，27%和17%。L组的优势菌属为魏斯氏菌属(Weissella)和肠杆菌属(Enterobacter)，相对丰度分别为37%，33%。M组的优势菌是乳杆菌属，相对丰度为64%。ML组的优势菌为乳杆菌属(Lactobacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)和魏斯氏菌属(Weissella)，相对丰度分别23%，32%，19%。其他菌属包括泛菌属(Pantoea)、埃希氏-志贺菌(Escherichia-Shigella)、拉乌尔菌属(Raoultella)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、明串珠菌属(Leuconostoc)、气球菌属(Aerococcus)等，其相对丰度在四个处理组中均不超于10%。M组中乳杆菌属为显著优势菌属，说明添加糖蜜可以提高乳杆菌属的相对丰度，降低肠杆菌属、魏斯氏菌属及其他菌属的相对丰度。

图3 构树叶青贮细菌群落组成(门和属水平)

2.5 不同添加剂处理对青贮菌群丰度的影响

由图4(A)可知，在门水平上，四组处理相对丰度较高的两种细菌是厚壁菌门和变形菌门。与CK组相比，M组厚壁菌门相对丰度显著提高(P<0.05)，而变形菌门相对丰度显著降低(P<0.05)；相反，L和ML组的厚壁菌门相对丰度降低，变形菌门相对丰度提升。不同添加处理对构树叶青贮细菌相对丰度的影响存在明显差异，由图4(B)可知，在属水平上，相对丰度较高的菌属为魏斯氏菌属、肠杆菌属和乳杆菌属。与CK组相比，L组乳杆菌属相对丰度显著降低(P<0.05)，ML的乳杆菌属相对丰度组则显著提高(P<0.05)，M组的乳杆菌属相对丰度极显著提高(P<0.01)；M组的魏斯氏菌属和肠杆菌属相对丰度极显著降低(P<0.01)，L组的肠杆菌属相对丰度显著上升(P<0.05)，ML组的魏斯氏菌属相对丰度显著下降(P<0.05)。由此可知，糖蜜(M)的单独添加明显改变了青贮细菌的菌群相对丰度，使乳杆菌属大幅增加，肠杆菌属、魏斯氏菌属等不利菌显著减少，有助于青贮发酵品质的提升。

图4 构树叶青贮细菌丰度差异分析

3 讨论

3.1 乳酸菌和糖蜜对构树青贮饲料发酵品质的影响

青贮发酵品质是由pH值和乳酸等有机酸及多因素共同决定的[11]。优良的青贮饲料含有较多的乳酸、丙酸以及少量的乙酸[12]。青贮饲料pH值低说明发酵效果好，反之越差，决定青贮饲料pH值下降的主要因素是乳酸和乙酸的含量，其中乳酸和乙酸的含量比是判断青贮发酵好坏的重要指标。在本实验中，糖蜜(M)及乳酸菌、糖蜜(ML)的混合添加使构树叶青贮的乳酸含量与对照组相比有显著提高(P<0.05)，且乳酸∶乙酸比例均大于1，该乳酸含量比对青贮发酵具有改善作用，与王超等[13]研究结果一致。构树叶青贮饲料中添加糖蜜产生的乳酸最多，糖蜜的添加为乳酸菌发酵提供动力，使青贮饲料产生大量乳酸，进而降低青贮料pH值，抑制有害菌的生长，保证发酵产品的质量[14]。本实验中，糖蜜和糖蜜、乳酸菌混合添加这两个处理组对青贮发酵品质提升有促进作用，而乳酸菌添加处理对改善构树叶青贮发酵品质没有效果，说明发酵底物的缺乏对青贮发酵品质的限制作用远大于乳酸菌数量的添加。华金玲等[15]研究结果也表明，乳酸菌单独添加发酵效果不佳，为了提高发酵的质量需要添加糖类。穆麟等[16]研究表明糖蜜的添加可以降低青贮料pH值，与本实验研究结果一致。乳酸菌的添加增加了发酵饲料的乳酸菌数量，其生长需消耗大量的发酵底物产生乳酸，但构树原料本身含糖少，无法提供更多的发酵底物，糖蜜的添加则补足了发酵底物，促进青贮饲料中的乳酸菌生长，而单独添加乳酸菌不能起到促进作用。

3.2 乳酸菌和糖蜜对青贮发酵过程中细菌多样性的影响

青贮饲料发酵质量的好坏很大程度上由微生物组成决定[17]。青贮饲料发酵过程中菌群的丰度和结构的变化影响着青贮饲料的发酵品质和营养成分[18]。细菌群落组成对于控制发酵质量非常重要，发酵过程实质为乳酸菌与其他菌群间的动态变化[19]。充足的发酵基质和乳酸菌数量是青贮过程中发酵成功的关键因素[20]。青贮厌氧环境提供了乳酸菌生长条件，添加糖蜜为菌群生长提供了营养，使细菌快速繁殖，影响并改变青贮饲料的细菌结构[21]。在门水平上，构树青贮菌群中四个处理组占绝对优势的是厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)。Eikmeyer等[22]研究中发现，在饲草青贮过程中，厚壁菌门占比较大。McGarvey等人[23]认为，苜蓿青贮饲料的主要优势菌门是厚壁菌门和变形菌门。两个研究均与本实验结果一致。在属水平上，乳杆菌属(Lactobacillus)和魏斯氏菌属(Weissella)、肠杆菌属(Enterobacter)在四个处理组菌群中占优势。研究发现，一般青贮发酵过程乳杆菌属为主要优势菌属，与本实验研究结果一致[24-25]。乳杆菌属和魏斯氏菌属通常能够降低青贮环境的pH值，保证青贮发酵品质，乳杆菌属的作用效果更佳，而肠杆菌属属于不良菌，肠杆菌属的相对丰度增加使青贮环境pH值上升，限制其他有益菌的生长，不利于青贮发酵。乳杆菌属能够产生乳酸，降低青贮环境pH值，在青贮发酵过程起重要作用。糖蜜添加组(M)的乳杆菌属相对丰度比魏斯氏菌属高，其原因可能是魏斯氏菌属主要在发酵前期发挥作用，发酵后期因糖蜜水解后为乳杆菌属生长提供营养条件，使得乳杆菌属数量快速增长。本研究结果表明，糖蜜的加入使构树青贮pH值显著下降(P<0.05)，由此可得出添加糖蜜后乳杆菌属的相对丰度上升，对青贮有利，对改善青贮饲料发酵品质有明显效果。张想峰等[26]认为乳酸杆菌对青贮发酵起重要作用，杨杨等[27]认为乳杆菌属在青贮中，发挥着重要的作用，研究结果与本实验一致。综上研究结果可得，乳杆菌属在青贮细菌群落结构中为优势细菌，在保证青贮发酵品质中发挥主要作用。

4 结论

构树叶直接青贮品质不佳，添加糖蜜或混合添加糖蜜、乳酸菌均能一定程度的改善青贮发酵品质，单独添加乳酸菌对改善青贮发酵品质未起到良好作用。另外，糖蜜的添加改变构树叶青贮饲料细菌群落结构，使乳杆菌属相对丰度升高，魏斯氏菌属和肠杆菌属相对丰度降低，利于青贮发酵。综合考虑，构树叶青贮时单独添加糖蜜便可获得良好的效果。