急性期骨科钛合金板表面金黄色葡萄球菌细菌生物膜的结构演变

陈明礼，陈宗霖，杨荣源，薛观錡，黄淼，钮朋

(1.福建医科大学附属漳州市医院骨科，福建 漳州 363000；2.福建医科大学，福建 福州 350000；3.南阳市第二人民医院骨科，河南 南阳 473000)

金黄色葡萄球菌广泛分布于人体体表，其与许多骨科内植物感染相关[1]。国外文献报道每年骨科关节置换术中膝关节假体周围感染发生率为0.5%～2.0%，翻修感染率为2.0%～4.0%[2-3]，髋关节假体周围感染发生率为0.3%～1.0%[4]，而多处假体置换的感染率更高[5]，多以金黄色葡萄球菌感染为主[6-7]，这也是关节翻修主要的原因之一[8]。骨科术后内植物相关感染是骨科医师十分棘手的事，主要原因在于植入物表面细菌生物膜的形成，生物膜由细菌及其自身产生的细胞外多糖基质组成[9]，是一种复杂的微生物群落，处于低代谢状态，适应外界环境能力强，使存活其中的细菌免受宿主免疫攻击和抗生素制剂的影响，较浮游菌相比表现出更强的耐药性，使感染难以控制，而这样的环境会促使耐药菌株出现[10-11]。临床表明生物膜难以去除常需要联合抗生素并多次手术病灶清除，甚至取出内固定装置等综合治疗[12-13]，对患者造成极大痛苦，使治疗难度增大，医疗成本升高[14]。临床对急性期生物膜的研究较少，因此研究内植物表面金黄色葡萄球菌生物膜形态结构演化意义重大，对临床内植物相关感染治疗有一定指导意义。

临床上4周之内的骨科内植物相关感染称为急性感染，主要是以保留假体为主的清创联合抗感染的综合治疗[12]，但手术时机和方式主要取决术者临床经验。迄今为止，对于骨科内植物相关感染治疗还没有统一的治疗标准，这使得外科医生很难准确把握手术时机和达到确切的治疗效果。因此，笔者制作急性期内不同时相点的金黄色葡萄球菌生物膜体外模型，观察生物膜形态演变，使临床医生对假体细菌生物膜的理解更加深入，更好的做出临床决策。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器 材料：金黄色葡萄球菌标准菌株(ACTT25923，人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院微生物室提供)；骨科内植物钛合金板(Ti6Al4V，直径12.7 mm，厚度4.7 mm，深圳斯玛仪器有限公司)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)和异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白A(FITC-ConA)荧光染色剂(美国Sigma公司)，胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth，TSB；广东环凯微生物科技有限公司)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS；美国Corning公司)，戊二醛固定液(南京森贝伽生物科技有限公司)，乙醇溶液(山东利尔康医疗科技股份有限公司)。

仪器：激光共聚焦显微镜(FV l000，日本OLYMPUS公司)，Quanta 450扫描电子显微镜(美国FEI公司)，隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，普通琼脂培养皿(青岛日水生物科技有限公司)，24孔组织培养板(青岛日水生物科技有限公司)，共聚焦显微镜专业皿(美国Sigma公司)，K850临界点干燥仪(美国FEI公司)，超声清洗机(深圳洁盟清洗设备有限公司)，旋涡震荡仪(美国Scientific Industries公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 制作细菌生物膜体外模型 参照Unnanuntana造模方法[15]，取少量斜面保种金黄色葡萄球菌标准菌株接种于10 mL TSB中，置恒温培养箱(37 ℃、5% CO2)中过夜复苏，再取微量菌液4区划线法接种于血平板培养基培养获得菌落。取单个菌落溶解于玻璃瓶中，使比浊仪显示浊度为0.5，取1 mL菌液溶解于149 mL无菌PBS培养基中，使菌液达到最终浓度1×106CFU/mL备用。将钛合金板清洗、干燥、灭菌预处理后放入24孔板中，每孔加入1 mL浓度为1×106CFU/mL菌悬液，置37℃、5% CO2的恒温培养箱中，每隔24 h用无菌TSB液体换液1次，分别培养1、2、3、4周形成相应时间的细菌生物膜。

1.2.2 实验分组 实验共需120枚钛合金板，建立4个培养不同时期的生物膜，每个时相点各30枚。将各时相点培养好的生物膜中随机挑选10枚用于扫描电镜观察，10枚用于激光共聚焦显微镜观察，10枚用于活菌计数。

1.3 观察指标

1.3.1 激光共聚焦显微镜观察细菌生物膜结构 分别在钛合金板表面建立1、2、3、4周的生物膜体外模型，将各时相点培养好的生物膜中随机各选取10枚钛合金板，经FITC-ConA避光染色30 min后PI避光染色15 min，染色后用PBS清洗，待干燥后置于观察皿中，激光共聚焦显微镜下观察(FITC-ConA与生物膜中的胞外多聚物结合激光共聚焦显微镜观察呈绿色荧光，PI与菌体内的DNA结合激光共聚焦显微镜观察呈红色荧光，两者重叠呈橙色荧光)荧光数量、亮度、分布方式来分析生物膜及膜中活菌、死菌形成变化；沿三维坐标系，Z轴逐层水平扫描，Z轴距离为生物膜厚度(μm)。

1.3.2 扫描电镜观察细菌生物膜结构 将各时相点培养好的生物膜中各随机取10枚钛合金板，25 g/L戊二醛固定2 h，分别经浓度为30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇脱水。完成后置于K850临界点干燥仪处理，后置于Q 150R S/E/ES样品制备系统喷金，在扫描显微镜下逐个观察不同时相点细菌生物膜多聚物的数量、形态、空间分布及微环境结构，并选取典型结构的视野拍照记录。

1.3.3 活菌计数 将各时相点培养好的生物膜中各随机取10枚，PBS冲洗后放于10 mL PBS的培养瓶中，置于超声清洗机及旋涡震荡仪作用后，洗脱液进行稀释，取100 μL滴加于普通营养琼脂平板中央，三角推棒均匀涂布，置于37℃、50 g/L CO2的恒温培养箱中培养48 h后行活菌计数。

1.4 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。采用单因素方差分析，各组间比较采用LSD检验，检验水平设为0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各时相点生物膜的共聚焦扫描图像 1周时绿色荧光少、较弱、稀疏的局限于红色荧光周围，红色荧光较多明显，表明早期胞外多聚物量少，散在分布于菌体周边(见图1a)；2周时绿色荧光明显增多，亮度增强，红色荧光也增多，局部荧光相连，表明生物膜胞外多糖聚合物增多，细菌存留生物膜的数量也增多，生物膜互相连接(见图1b)；3周时绿色荧光增加，变密，红色荧光较暗淡，表明生物膜进一步增加，局部聚集，不均匀分布(见图1c)；4周时绿色荧光大量分布连成片状，表面高低起伏，表明大量生物膜形成，结构紧密，表面不均一状(见图1d)。

a 1周时生物膜共聚焦扫描结构图

b 2周时生物膜共聚焦扫描结构图

c 3周时生物膜共聚焦扫描结构图

d 4周时生物膜共聚焦扫描结构图

a 1周时的细菌生物膜 b 2周时的细菌生物膜 c 3周时的细菌生物膜 d 4周时的细菌生物膜

2.2 各时相点细菌生物膜的扫描电镜图像 1周时生物膜胞外多糖聚合物较少，局限菌体之间，细菌之间少量孔道形成；2周时细菌胞外多聚物增多，微孔道增多；3周时胞外多聚物进一步增多，细菌多聚物融合成团块状；4周时形成大量胞外多聚物，生物膜具有一定厚度，呈蜂巢状，膜内孔道分明，相互交通，局部生物膜解聚游离(见图2)。

2.3 各时相点细菌生物膜的厚度及生物膜中的活菌计数 培养1、2、3、4周的金黄色葡萄球菌细菌生物膜厚度逐渐增厚，各组之间有统计学差异(P<0.05)。培养1、2、3、4周的金黄色葡萄球菌细菌生物膜内的活菌总体趋于稳定，各组之间差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1 不同时相点各组的细菌生物膜厚度及活菌数统计结果

3 讨 论

金黄色葡萄球菌是人体表面常驻菌群，也是骨科假体周围感染最主要的细菌[11]。骨科内植物材料大多是钛合金，因此实验选用金黄色葡萄球菌来培养细菌生物膜，以钛合金板作为载体。假体周围感染是骨科灾难性并发症，主要原因是假体表面细菌生物膜的形成，临床对于1个月内的假体周围感染，一般定为急性感染，治疗以保留假体的病灶清除[13]为主。而急性期不同时间段的细菌生物膜演变对于手术时机选择以及术后感染再发率预判有指导作用。因此实验时间间隔为1周。

实验发现，培养1周后生物膜整体以细菌为主，细菌胞外多糖聚合物少，呈点状，内部空间结构简单；2周时细菌胞外多糖聚合物增多，菌群直接通过细丝状多聚物相连接，菌体清晰可见，这和很多文献报道的几小时形成细菌生物膜有很多区别[16-17]，考虑是由于不同种类细菌的生物膜的形成能力不同。同种细菌在不同的环境下生物膜的形成能力也有区别，野生菌种和实验室的菌种在生物膜形成能力上也存在差异。实验发现培养1周时细菌外膜上的凸起(图2a黄色箭头)就是生物膜的组成成分，共聚焦显微镜观察到凸起是生物膜形成早期最主要的特征，且扫描电镜也观察到培养1周时细菌外膜的凸起就是胞外多糖聚合物，2周时形成更多胞外多糖聚合物(图2b黄色箭头)，此时细菌及胞外多糖聚合物共同组成生物膜，胞外多糖聚合物合成少，由此可以推测保留假体治疗成功率较高。实验发现培养3周时生物膜厚度增加，胞外多糖聚合物进一步增多，呈层状空间结构，包裹大多数菌体，此时观察到局部细菌解聚现象(图2c红色箭头)，这与Takahashi等报道相一致[18]，表明此时治疗难度增大，感染治疗成功率较低。到了4周形成大量胞外多糖聚合物，包裹菌体，此时生物膜层次分明，内部孔道繁多(图2d蓝色箭头)，此时的感染则难以控制。相关文献表明不同时期的生物膜，胞外多糖聚合物对内部细菌保护作用不同，文献报道对于培养24 h的金黄色葡萄球菌细菌生物膜0.5%碘伏能杀灭浮游状态的细菌，而对于培养更长时间的金黄色葡萄球菌生物膜碘伏杀菌作用减弱[19-20]，表明了不同时期胞外多糖聚合物形成的屏障保护作用不同。临床上有研究报道，急性期保留假体治疗成功率高低不等，低的为44%[21]，而高的为71%[22]，推测导致这一波动的原因主要是不同时期生物膜成熟程度的区别。研究发现低剂量抗生素的作用会导致生物膜内耐药菌体的形成[23]，是由于生物膜底层环境恶劣，生物膜内的细菌营养供应不足，细菌代谢废物的堆积，使得内部细菌处于低代谢状态，这些与细菌形成耐药性密切相关[24-25]。内部孔道结构使低代谢的细菌得以存活并且相互之间可以信息交流[26]，使内部细菌伺机而动。当环境发生变化，生物膜开始解聚，处于休眠状态的细菌复苏并重新游离出来，使临床患者症状反复发作[27]。生物膜结构类似“人类社区分布”，生物膜外观类似房屋高低不同，呈现不均一性，各区域厚度不统一，生物膜内的细菌好比是房屋内的居民，一定范围内的生物膜中细菌总数趋于稳定[28]。另外细菌生物膜有早期生物膜和晚期生物膜，早期生物膜中细菌比例高，晚期生物膜胞外多糖聚合物比例高，结构化程度高，功能完善，抗外界干扰越强，消灭困难。

临床上保留假体的清创治疗的手术时机尚无统一定论，但一般是尽早给予施行手术。文献报道，对于4周内的假体相关感染，可以给予保留假体的清创治疗，但成功率大小不一[29]。Grammatopoulos等[30]回顾18年的保留假体清创病例，发现4周内和4周后保留假体清创差异无统计学意义，说明4周内和4周后的细菌生物膜变化不大。本实验研究发现对于金黄色葡萄球菌生物膜有早期生物膜和晚期生物膜区别，而且3周是临界值。

综上所述，金黄色葡萄球菌生物膜是一个逐渐成熟的过程，到3周时形成较稳定生物膜，主要表现是形成大量的细菌胞外多糖聚合物包裹细菌并形成空间结构化，内部环境有序化的过程，这也是早期生物膜和晚期生物膜的区别。根据本研究结果推荐内置物感染越早清创越好，对于3周以内的金黄色葡萄球菌感染保留假体清创成功率较高。

本实验不足之处：本实验为体外研究实验，与体内环境相差较大，文章只选取临床假体相关感染最为常见的金黄色葡萄球菌种作为研究对象，缺少其他细菌及混合菌感染相关研究，也缺少在动物实验及临床上对于保留假体清创的详细比较研究。相关内容还有待于后续研究进一步验证。