血清软骨寡聚基质蛋白水平与膝骨关节炎发生发展的关系研究

刘昌海，王占朝，张豪杰，李蓉

(上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院骨科，上海 202150)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性退行性关节疾病，主要表现为关节软骨的局灶性病变，并伴有软骨下骨硬化和关节边缘的新骨形成(骨赘)以及轻度、慢性非特异性炎症性滑膜炎[1-2]。中国症状性膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)患病率约为8.1%，KOA的严重程度通常从放射学检查的无症状、偶然发现到晚期失能障碍不等。严重的软骨缺失导致KOA患者关节疼痛，僵直畸形和功能障碍，生活质量恶化，甚至死亡[3]。能够反映疾病进展动态和定量变化的生物标志物对于减少KOA的不利影响具有相当重要的意义。软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)属于血栓反应蛋白家族，是构成细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的一种重要蛋白[4]。既往研究发现COMP的表达与骨髓间充质干细胞的软骨分化、软骨外基质形成及维持软骨细胞表型均有相关性，因此可能与KOA的疾病进展有关[5]，然而目前尚缺乏足够的临床证据。因此，本研究旨在通过观察性研究分析血清COMP与膝关节症状、关节结构改变以及KOA患者软骨或骨生物标志物之间的关系，从而为血清COMP的临床应用提供有力的支持。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2012年4月至2019年3月期间在上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院骨科收治的双侧KOA患者255例(KOA组)作为研究对象，其中男168例，女87例；年龄28～85岁，平均年龄(59.77±11.01)岁。KOA患者根据《骨关节炎诊治指南(2007年版)》[6]的症状标准和Kellgren-Lawrence(K/L)分级标准进行诊断。此外，研究对象还应符合以下纳入标准：(1)K/L分级≥2级；(2)临床和生化资料完整，且依从性良好，均知情同意本研究。排除标准：(1)合并膝关节手术史、创伤史、关节周围骨折；(2)合并椎管狭窄病史、神经系统疾病或继发性(炎症或代谢)关节炎病史者；(3)合并恶性肿瘤，严重心、肝、肾功能障碍，痛风病史，感染或自身免疫性疾病者。对照组100例非KOA受试者从正在接受体检的健康志愿者中选择，其中男67例，女33例；年龄20～86岁，平均年龄(58.96±12.42)岁。根据经验丰富的骨科医生对膝关节进行临床检查，排除任何症状性或影像学OA证据。与KOA组比较，对照组年龄、性别构成具有可比性(P>0.05)。本研究为观察性横断面研究，在获得本院伦理委员会批准并遵循《赫尔辛基宣言》的前提下进行。

1.2 血清COMP水平检测 受试者休息30 min后抽取5 mL外周静脉血置于普通样品瓶，然后于室温下以3 000 rpm的速度离心15 min，取上层清液血清于普通样品瓶中，储存于-20 ℃条件下直至检测。使用COMP酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒(BioVendor Laboratory Medicine，德国)，检出限为0.4 ng/mL，批内及批间变异系数分别为4%、3.1%。将储存的血清分成每孔0.1 mL等分，每孔预先包被生物素化的单克隆抗体。依次加入稀释缓冲液、工作液、显色剂，分别孵育90 min、60 min、20 min，共用洗涤液洗涤4次以去除未结合的抗体。使用设置为450 nm(Bio-Rad Laboratories，加拿大)的微孔板读数器测定每个孔的吸光度。采用四参数算法，将标准品的平均吸光度(Y)与已知标准品浓度(X)以对数标尺绘制标准品的标准曲线的回归方程式，将样品的吸光度值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以各自的稀释倍数，得到样品中血清COMP的实际浓度(ng/mL)。

1.3 影像学评估 采用1957年K/L分级[7]量表对所有患者进行放射学评估，K/L分级为0级(正常表现)：无骨赘及正常关节间隙；K/L分级为1级(可疑)：微小骨赘，病理意义可疑；K/L分级为2级(轻度)：无关节间隙狭窄的骨赘；K/L分级为3级(中度)：关节间隙中度狭窄；K/L分级为4级(严重)：严重关节间隙狭窄伴软骨下骨硬化。K/L分级1级、2级分为轻度组，3级、4级分为中重度组。

1.4 关节症状评估 所有受试者均完成了西安大略和麦克马斯特大学(the Western Ontario and McMaster Universities，WOMAC)骨关节炎指数[8]问卷调查(包括疼痛、关节僵硬及日常活动，共有24个题目，每个题目均采用5级评分法进行评分)及Lequesne指数[9]问卷调查(包括疼痛或不适、最大步行距离和日常活动)，WOMAC疼痛评估分为负重性疼痛(平地行走、上下楼梯及直立行走时)、非负重性疼痛(夜间卧床或坐卧时)。

2 结 果

2.1 两组受试者血清COMP水平比较 KOA组血清COMP水平为(2 492.40±1 071.80) ng/mL，对照组血清COMP水平为(1 426.05±932.93) ng/mL，KOA组显著高于对照组(P<0.001)。经ROC曲线分析，血清COMP水平诊断KOA的AUC为0.789(0.733～0.845)，在最佳截断阈值(1 785.65 ng/mL)下，灵敏度和特异性分别为68.91%和78.50%(见图1)。

图1 血清COMP水平诊断KOA的ROC曲线分析

2.2 KOA患者血清COMP水平与其他临床特征的关系 根据KOA患者的血清COMP水平中位值，将KOA患者分为低水平组(<2 210.59 ng/mL)及高水平组(≥2 210.59 ng/mL)。经分析，高水平组患者合并吸烟史概率、疼痛持续时间、Ⅲ型前胶原氨基末端肽(PⅢNP)均高于低水平组，同时站起-走计时测试(TUG)时间低于低水平组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.3 KOA患者血清COMP水平与WOMAC、Lequesne指数的关系 经Spearman秩相关分析，KOA患者血清COMP水平与WOMAC及Lequesne指数均呈正相关(r=0.195，0.393，P<0.05，见图2)。校正年龄、性别、病程等混杂因素后，经多元线性回归分析，KOA患者血清COMP水平与WOMAC-疼痛评分(β=2.85，95%CI=1.31～5.39，P=0.028)、WOMAC-关节功能评分(β=9.85，95%CI=4.33～17.29，P=0.034)及Lequesne指数(β=1.65，95%CI=1.24～2.99，P=0.015)仍存在正相关性。

图2 KOA患者血清COMP水平与WOMAC、 Lequesne指数的Spearman相关性

2.4 KOA患者血清COMP水平与K/L分级的相关性 经Spearman秩相关系数分析，KOA患者血清COMP水平与K/L分级呈正相关(r=0.481，P<0.05)。轻度组共有151例患者，中重度组共有104例患者。根据KOA患者的血清COMP水平四分位数，分为Q1(<1 635.41 ng/mL)、Q2(1 635.41～2 210.59 ng/mL)、Q3(2 210.59～3 143.87 ng/mL)、Q4(>3 143.87 ng/mL)。经单变量回归分析表明，所有研究对象中血清COMP水平分别在Q3和Q4区间时，K/L分级≥3级的风险分别增加4.333倍和11.980倍。在进一步校正年龄、性别等客观干扰因素后，血清COMP水平分别在Q3和Q4区间时，KOA患者进展至K/L分级≥3级的风险分别增加2.091倍和5.682倍(P<0.001，见表2)。

3 讨 论

本研究团队人员前期调研查阅国内相关文献后，发现本研究是目前国内最大样本量的一项关于血清COMP作为KOA生物标志物的适用性研究。本研究结果表明，KOA患者血清COMP水平显著高于对照组，并且血清COMP水平也随着KOA的严重程度而增加。研究结果表明，血清COMP水平有可能成为KOA诊断、监测严重程度和评估疾病进展的候选分子。此外KOA患者血清COMP水平与WOMAC及Lequesne指数均呈正相关，说明血清COMP水平可以积极预测KOA的临床和影像学水平，也进一步证实血清COMP可作为辅助影像学评估KOA患者病情进展程度的一种有效方法。

目前OA的发病率不断上升，但其早期变化在影像学上表现不明显，通常是在关节受损后才被确诊。因此，灵敏的诊断方法用于早期诊断，可以延迟患者不可逆的关节损伤。各种潜在的OA疾病修正治疗，如生物再生治疗、软骨成形

表1 不同血清COMP水平KOA患者一般临床资料分析

表2 单变量和多变量模型分析KOA患者血清COMP水平与K/L分级进展的关系

术和自体软骨细胞移植，有助于在患者出现不可逆骨和软组织并发症前，提高OA早期诊断和进展评估的准确率[10-11]。COMP是软骨降解的非胶原生物标志物，也称血栓反应蛋白5，最初从软骨中分离，后续研究发现在软骨和许多其他组织/细胞中也有表达[12]。已知COMP可参与胶原分泌和纤维生成，并与ECM的各种其他成分相互作用，如I、II、IX型胶原、基质蛋白3。虽然COMP基因突变与骨骼发育不良、假性软骨发育不全和多发性骨骺发育不良有关，但野生型COMP表达改变和/或全身性释放已在一些主要的年龄依赖性和退行性疾病中得到描述[13-15]。如Sandstedt等[13]发现COMP的降解与动脉粥样硬化疾病进展中的炎症反应有关，会产生特定的COMP片段；在肝纤维化相关研究中[14]，也发现循环COMP水平与胆道闭锁患者的肝纤维化程度及生存率相关；在Saghafi等[15]的研究中，COMP与类风湿性关节炎早期及晚期的疾病严重程度均呈正相关。总体来讲，COMP被认为是软骨ECM周转的一个非常具体的指标，在骨关节炎或类风湿性关节炎的关节退行性变期间，以及在过度体力活动或关节创伤导致的高负荷后COMP周转率会升高[16-17]。

既往研究表明[18]，受损关节软骨中的细胞有可能迁移到受损部位，导致这些区域的重新增殖。而COMP主要表达于软骨结构损伤最严重的上软骨区，COMP过表达可能是一种试图吸引周围软骨细胞来重建缺损部位的信号，并且通过COMP和血小板反应蛋白-4的相互作用进一步诱导ECM维持、保护和软骨修复机制。事实上，COMP被证明能够吸引软骨细胞并有助于其锚定[19]。这些研究都从分子机制方面解释了血清COMP在OA病变中的作用。在本研究中，与对照组相比，KOA患者(KL分级≥2级)血清COMP水平显著升高，表明血清COMP可作为KOA的诊断标志物；此外与轻度KOA组相比，中重度KOA组血清COMP水平进一步升高。与既往一些研究[16-17]不同的是KOA患者血清COMP升高与临床疼痛症状及放射学改变均有关，这也突出了其作为预后生物标志物以及监测疾病进展的生物标志物的潜力。

综上所述，本研究表明KOA患者血清COMP水平显著高于健康受试者，且随着KOA疾病严重程度的增加，血清COMP水平逐渐升高。血清COMP可能在KOA的发生发展中发挥重要作用，有望成为临床诊断或疾病进展评估的潜在生物标志物。本研究的局限性在于缺少早期KOA患者数据，所有确诊的KOA患者KL分级均≥2级，无法确定血清COMP水平是否在放射学软骨损伤证据出现前已经表达上调。还应注意的是，大多数确诊(晚期)KOA患者都患有双侧KOA，因此本研究纳入的患者都为双侧KOA患者，进一步扩充单侧KOA患者数据进行对比分析也是下一步工作的重点。