脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）在结核病诊断中的应用

亓 菲，刘蒙达，张皓博，范伟兴，孙淑芳，樊晓旭

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

结核病是由分枝杆菌属结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病，是世界上致命的传染病之一。全球每年共有活动性结核病病例达1 000 万例，其中儿童患者100 万例。2022 年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）报告显示，结核病死亡病例达140 万，目前仍有约36%的结核病新发病例未得到及时诊断和报告[1]。多数地区常规结核病诊断手段依赖于痰样本细菌培养。但是，该方法存在局限性：一方面痰样本很难获得，另一方面在儿童、肺外结核病患者、艾滋病病毒合并感染者中诊断敏感性较低。

所有分枝杆菌都表达一种独特的包膜糖脂，即脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）。LAM 暴露在分枝杆菌表面，与免疫原性相关，是一种潜在的毒力因子，可与白细胞结合并调节免疫反应。2014 年，WHO 呼吁“开发基于生物标志物的快速非痰液检测方法，旨在通过识别特征性生物标志物来检测所有形式的结核病”，并要求检测方法在能诊断活动性结核病的同时具有高特异性[2]。目前，LAM 已被建议作为结核病诊断的一种生物标志物，它能以可溶形式从活动性肺结核病患者的尿液中排出。尽管LAM 检测技术对单纯的结核病患者检测敏感性相对有限，但对免疫抑制结核病患者表现出很好的敏感性。由于尿液样本易于收集，该技术在免疫抑制结核病患者以及很难产生痰液的儿童及重症结核病患者中显示出巨大潜力。鉴于此，本综述介绍了LAM 的相关研究进展，特别是在结核病诊断方面的应用。

1 LAM 结构

LAM 是分枝杆菌细胞壁内三大相互关联的脂多糖群之一，通过糖脂锚定方式非共价连接到分枝杆菌质膜，并延伸到细胞壁表面。LAM 分子含有3 个主要结构域：（1）将LAM 分子与生物体质膜结合的糖磷脂锚；（2）在分枝杆菌中高度保守且与糖磷脂锚相连的核心结构；（3）具有可变甘露糖帽子和侧链的阿拉伯聚糖结构域[3]。这些结构的变化，可产生多种具有一系列独特性质和功能的LAM 分子。甘露糖帽子结构可促进分枝杆菌与巨噬细胞上的甘露糖受体结合，为生物体提供了首选的细胞内环境。

结核分枝杆菌强毒菌株（如H37Rv、Erdman或NYH-27）的LAM 与无毒菌株或临床分离菌株的LAM 在结构上存在差异，与其他致病性分枝杆菌（如麻风分枝杆菌）LAM 相比也有差异。LAM 结构的差异和多样性主要由以下方面决定：（1）末端连接的分子类型，即甘露糖（mannose，Man）、阿拉伯糖或甲基硫代-D-木糖（methylthio-D-xylose，MTX），可诱导复杂结构成分含量；（2）表位结构配置以及与Man连锁的MTX 分支，这是确定表位长度和结构组成的关键[4]。据观察，LAM 这些结构成分可动态变化，从而对表位识别造成影响。LAM 结构的改变会直接影响到一些抗体（CS-35、A194、MoAb1、S4-20、FIND 28、CS40 和CS906.7） 的特异性表位识别能力[4-5]。末端D-阿拉伯多糖侧链（mannose-capped LAM，ManLAM）上带有甘露糖基化帽LAM 分子，这是致病性分枝杆菌的特征性结构；而耻垢分枝杆菌中通常带有磷酸肌醇LAM（phosphatidyl-myo-inositol capped LAM，PILAM），其他快速生长的分枝杆菌如龟分枝杆菌中的LAM 没有甘露糖或磷酸肌醇帽化，被称为AraLAM 分子[3，6]。ManLAM 分子具有强大的免疫调节特性，而PILAM 和AraLAM 在人体内具有强烈的促炎症作用。研究发现，LAM 相对分子质量峰值集中在17.3 kDa，但峰值两侧多峰分布广泛，反映出相当大的分子异质性。因此，来自任何特定来源的LAM，在大小、侧链分支模式、甘露聚糖核心、阿拉伯多糖侧链酰化和磷酸化方面都存在差异。此外，LAM 具有热稳定性，在临床样本中不易降解，适用作诊断靶点。

2 LAM 功能

结核分枝杆菌在应激条件下具有很强适应能力，可以发生蛋白质组、脂组重排。在感染的不同阶段，糖脂分布以及LAM 与脂甘露聚糖（lipomannan，LM）的比值可发生变化。低浓度LAM 可诱导免疫系统的负反馈调节，这可能是由于LAM 具有多个表位，这些表位可与细胞表面受体以不同程度亲和力发生相互作用，例如暴露在嗜酸性粒细胞表面的CR3 凝集素结构域能与甘露糖相互作用，从而介导细菌摄取[7]。LAM 具有不同数量的甘露糖单位，而甘露糖浓度增加直接影响树突状细胞成熟及其功能。从结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌中分离的LAM 会抑制T 细胞增殖，影响γ干扰素介导的巨噬细胞活化，抑制蛋白激酶活性，促进单核细胞产生肿瘤坏死因子，以及介导补体激活[8]。

在对先天性免疫的调节中，LAM 等毒力因子通过影响免疫细胞（如肺泡上皮细胞、巨噬细胞和树突状细胞）的活性和功能对抗宿主防御系统。LAM 通过TLR-2 信号传导、p38 表达上调、ERK1/2 磷酸化诱导人类II 型肺泡上皮细胞产生白细胞介素（IL）-37[9]。IL-37 可与Smad3（SMAD家族成员3）形成复合物，被转移到细胞核中，从而抑制促炎细胞因子的信号转导[10]。LAM 能够阻断免疫细胞亚群的激活和分化。例如，通过体外试验证实，暴露于LAM 的单核细胞无法分化为成熟巨噬细胞，其表型上缺乏CD86、TLR2 和TLR4表达。这些巨噬细胞肿瘤坏死因子的细胞内信号激活功能受损，导致PAR2 通路在控制细胞内Mtb生长方面存在功能缺陷[11]。LAM 影响了中性粒细胞通过CD11b/CD18 分子吞噬分枝杆菌。LAM 作用于中性粒细胞膜上富含乳糖神经酰胺的脂筏，从而破坏酪氨酸蛋白激酶信号，抑制造血细胞激酶与Lyn 酪氨酸激酶关联，防止吞噬溶酶体形成、细胞因子产生、脱颗粒和呼吸爆发[12]。LAM 通过抑制吞噬体成熟，影响先天性免疫反应激活和进一步发挥作用。LAM 与TLR1 1805G/T 多态性相关，因而增加了宿主对结核分枝杆菌的易感性。此外，结核病患者血清中循环的LAM 通过高密度脂蛋白，提高了人类巨噬细胞对分枝杆菌的易感性，显著抑制了肿瘤坏死因子的生成。上述研究表明，LAM可影响先天免疫细胞的表型和功能，并进一步延迟先天免疫反应，削弱反应效果。

在对获得性免疫的调节中，LAM 促进产生IL-10 的B 细胞（B-10）亚群（CD1 低CD5+）数量增加，而LAM 被B-10 细胞表达的TLR2 识别，进一步有利于通过AP-1 产生IL-10。富含IL-10的微环境可促进结核分枝杆菌的存活，抑制宿主的促炎免疫防御反应。LAM 主要在脂筏部位插入CD4+T 细胞膜，阻断Zeta 链相关蛋白激酶70（ZAP-70）、CD3ζ 链（CD3ζ）、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶和激活T 细胞连接子等的分子磷酸化，抑制通过经典TCR 依赖途径激活CD4+T 细胞，还可以通过上调淋巴细胞无能相关基因（genes related to anergy in lymphocytes，GRAIL），导致CD4+T 细胞活性受损[13]。

3 LAM 在结核病诊断中的应用

根据LAM 特性，将其作为生物标志物，开发了相关免疫学诊断方法。但是，LAM 是一种水溶性分子，不能采取从细胞中提取（相似相溶）的方法。随着技术的不断发展，在保证其生物学活性前提下的提取、纯化、制备特异性单克隆抗体（简称单抗）工艺日益成熟，人们相应开发了检测尿液、血清中LAM 的ELISA 试剂盒。

3.1 LAM 纯化

LAM 是一种大的双亲性分子，具有高度的内在分子异质性。分枝杆菌细胞包膜中含有与LAM结构相关的分子，如LM、阿拉伯甘露聚糖、磷脂酰肌醇甘露糖苷（phosphatidylmyo-inositol mannosides，PIM）和甘露聚糖等，从而影响了其纯度提取。因此，获得LAM 的均质组分需要实现以下关键步骤：去除蛋白质和核酸干扰物，疏水作用色谱法分离脂多糖，尺寸排除色谱法分离脂聚糖。在几十年前的研究中，对LAM 的纯化采用了不同的程序，如疏水作用色谱法，以及离子交换色谱法与凝胶过滤法相结合，1999 年Hamasur 等[14]发明了更简单方便且高产的氯仿-甲醇萃取结合凝胶过滤的方法。

Cantera 等[15]提出：LAM 免疫检测的敏感性受到限制是由于采用了体外培养结核分枝杆菌提纯的LAM 抗原，而不是从临床患者体内尿液样本中纯化的LAM。他们认为尿LAM（urine LAM，uLAM）对新型uLAM 特异性抗体开发和筛选至关重要，纯化后的LAM 可用于开发更加敏感的活动性结核病uLAM 诊断方法。他们提供了一种可以从大量尿液中有效富集uLAM 的基本方法，但需要继续开发改进，比如处理具有更高uLAM 浓度的大量尿液来收获更高产量的uLAM。另一种非免疫亲和方法是使用重组人甘露糖结合凝集素。该凝集素可与LAM 甘露聚糖帽子结构相互作用，在中等体积（500 mL）的尿液样本中的纯化效率高达51.4%，但纯化的uLAM 量非常低，不足以通过SDS-PAGE 和蛋白质印迹对LAM 进行典型分子分析。目前还没有商业化的LAM 提纯试剂盒，但有国内外品牌（如上海羽哚生物、杭州华葵金配生物、美国MOSS 等）的LAM 抗原产品。

3.2 LAM 单抗制备

为进一步提高对LAM 的检测性能，有关抗LAM 单抗的研究一直在继续。目前制备的单抗主要包括检测LAM Ara4 和Ara6 结构的单抗（A194-01、CS-35、900 系列）以及严格依赖Ara6 结构的单抗（FIND 系列），还包括天然人源单抗（P30B9）、小鼠源单抗（CS-40）和4 种来源于噬菌体展示文库（My2F12、MoAb1、MoAb2 和MoAb3）的单抗，另有通过肺结核病患者记忆B 细胞体外培养，制备的A194 单抗等[3]。鼠抗LAM 单抗（如CS-35）是目前国际上公认有效的抗LAM 单抗，目前暂无商品化抗LAM 单抗。

高亲和力抗LAM 单抗CS-35 是由麻风分枝杆菌接种小鼠后制备的，也是唯一一种通过X 射线晶体学方法获悉详细表位结合信息的单抗。Yan等[16]用结核分枝杆菌H37Rv 株细胞壁成分免疫家兔，建立了免疫单链可变区片段（scFv）噬菌体展示文库；通过ELISA 筛选，鉴定了针对LAM 的scFv 单抗；通过对所选克隆的轻链和重链可变区基因进行测序，构建了包含全长轻链和重链的载体，并在293 T 细胞中共表达，产生完整的IgG 抗体；采用多种免疫分析方法，测定了抗结核分枝杆菌H37Rv 纯化LAM 的单抗对多种分枝杆菌的性能和结合特性，发现这种新型兔抗LAM 特异性单抗能够较好地识别生长缓慢的致病性分枝杆菌LAM。

3.3 尿液中LAM 检测方法

Hamasur 等[17]首次提出将LAM 作为结核病诊断的生物标志物。研究发现：在肾脏的血液过滤过程中，肾小球内皮细胞形成了一个网状结构，其中孔径可容纳携带LAM 的Mtb 从膜分子或细胞外囊泡通过，使LAM 通过尿液排出；通过建立酶联免疫吸附试验（ELISA）来检测尿中LAM 的含量，从而进行结核病诊断。尿液LAM 检测方法对于诊断晚期免疫缺陷和CD4 细胞计数低的艾滋病病毒（HIV）感染相关结核病患者具有很好的敏感性。2005 年，美国Chemogen 公司开发了检测尿液LAM 的ELISA 试剂盒，后来将其更名为Clearview™ TB ELISA 试剂盒。2012 年，美国Alere 公司Determine™ TB LAM 检测试剂盒问世。Clearview 与Determine 试剂盒相比，在450 nm处读取OD 值后判定的结果几乎相同（Determine 24/85、Clearview 23/85），且在30 min 内能得到结果[18]。

侧流尿脂阿拉伯甘露聚糖（lateral flow urine lipoarabinomannan，LF-LAM）检测是一种商业化的活动性肺结核病床旁检测方法，是WHO 推荐的床旁结核病检测方法之一，可用于CD4 细胞计数低的HIV 合并感染结核病患者或重症患者的诊断，包括HIV 阳性的成年人、青少年和有结核病症状（肺或肺外）住院及门诊患者。LF-LAM 最突出的优势是价格低，仅为核酸扩增检测价格的1/3～1/4。LF-LAM 的灵敏度不是最佳，对于CD4细胞计数大于200 细胞/mm3的患者不建议进行LAM 检测[19]。在一项来自南非、越南和加纳共1 595 名HIV-分枝杆菌感染患者的Alere LAM 诊断研究中，应用微生物学参考标准评估敏感性和特异性，发现LF-LAM 的总体敏感性为34.9%，特异性为95.3%；使用复合参考标准进行微生物学确诊和结核病患者临床诊断，发现LF-LAM 的敏感性为31.4%；在CD4 细胞计数≤100 个/μL 的患者中，LF-LAM 的敏感性为56.0%；在CD4 细胞计数为＞200 个/μL 的患者中，LF-LAM 的敏感性为10.9%[20]。

日本开发的Fujifilm SILVAMP TB 尿液LAM 检测试剂盒（简称FujiLAM），诊断需50～60 min。该方法在读取结果时不使用参考卡，测试线显色即判为阳性。该检测技术采取了一对高亲和力单抗，主要针对结核分枝杆菌的特异性LAM 表位，通过银扩增可增加待检和对照品测试线的可见度，使待检尿液中LAM 浓度较LF-LAM 检测限降低约1/30，有望提高床旁结核病的检测效率[21]。在对389 名可获得现场尿和晨尿的艾滋病-结核病患者尿样的检测中，患者的CD4 细胞计数中位数为176个/μL，现场尿与晨尿测试结果的总体一致性为94.6%，与微生物参考标准相比，FujiLAM 检测现场尿和晨尿的敏感性分别为67.4%和69.8%，特异性分别为90.2%和89.0%，双样本策略将FujiLAM灵敏度从67.4%提高到74.4%，而特异性从90.2%降低到87.3%[22]。这项研究表明，FujiLAM 在现场尿和清晨尿样本上的检测表现相当，采用双样本检测策略可以提高灵敏度，但有降低特异性的风险，这些数据可以为未来的指南和临床实践提供信息。

在欧洲，人们利用光子生物传感器，开发了实时检测尿液LAM 的床旁检测方法。这种方法原理是当特异性抗体（anti-LAM）与抗原发生特异性结合时，光折射率会发生变化，通过干涉仪和芯片光谱的共振波长偏移测量信号判定结果。通过免疫反应分析，可以在15 min 内对未稀释的人尿液样本进行结核病检测；检测仅需要150 μL 的尿液，尿液LAM 的检测限为475 pg/mL；与目前商业化结核病LAM 检测试剂相比，生物传感实时检测LAM 法表现出较高的灵敏度（100%）和特异性（100%）[23]。

3.4 血清中LAM 检测方法

通过使用特异性荧光标记抗体结合共聚焦显微镜扫描观察发现，LAM 能够与膜细胞结合，表现出双亲和特性，这将为结核分枝杆菌的免疫分析检测提供新的思路。这种方法不仅可以检测组织学标本中的LAM，还可以检测外周血中的LAM。用ELISA 方法检测血液中的LAM 抗原发现：该检测对痰涂片阳性活动性肺结核病患者的敏感性为88%，对痰中抗酸杆菌阴性的活动性肺结核病患者的敏感性为67%，对艾滋病-结核病患者的检测结果不太理想，敏感性仅为57%，对结核病患者的特异性为91.5%[24]。与尿液LAM 检测相比，血液LAM-ELISA 对免疫抑制结核病患者的敏感性较低，其中LAM 可以在细菌囊泡内移动，这可能是LAM 逃避抗体识别的原因之一。基质效应研究表明，交叉反应、低吸附、免疫复合物干扰或血清LAM 浓度低、LAM-HDL 或LAM 蛋白复合物干扰等因素会影响检测的敏感性。其中，Laurentius等[25]指出LAM 与蛋白相互作用是血液LAM 检测的主要干扰因素，建议用酸（HClO4）、加热或甲醇处理人血清中的蛋白质使其变性，以提高ELISA检测的敏感性。

4 LAM 应用展望

LAM 是一种很有应用前景的结核病诊断生物标志物，无论患者是否感染HIV，无论结核分枝杆菌感染部位在哪，基于LAM 的检测有望用于成人和儿童结核病的诊断。然而，尿液LAM 检测仍存在一些局限性，例如对单纯结核病患者的检测敏感性低、单抗特异性低，结核病患者临床特征也会干扰诊断分析。血清LAM 检测的局限性包括：样本基质效应干扰、LAM 与细胞或可溶性分子相互作用、LAM 表位结构变化。除此之外，检测还可能受到试剂的影响（例如非结核分枝杆菌抗体与LAM 的交叉反应性）、不同样本类型的LAM 结构差异影响，以及分析设计和检测平台等因素的影响。

针对目前方法存在的不足，一是利用结构生物学等手段，找到更保守、免疫原性更高的LAM结构表位；二是优化天然LAM 纯化工艺、人工合成LAM 工艺等，在保证其生物学活性的前体下提高产量；三是通过重组表达等技术，开发高特异性、高亲和力单抗；四是充分把握技术发展红利，融合生物传感、化学、电、磁、光学等多学科，进一步增强和放大特异性信号，提高检测的灵敏度，延长检测的窗口期。今后需建立基于LAM 生物标志物的便携、快速、经济的现场快速诊断方法，作为目前结核病经典诊断方法的补充，以提高结核病病原的甄别效率。