基于斑马鱼模型汉麻仁脱脂粉降尿酸作用

董艳，张正海，魏连会，宋淑敏，姬妍茹，石杰

黑龙江省科学院大庆分院（大庆 163316）

高尿酸血症是一种由嘌呤代谢紊乱导致血液尿酸水平异常高引起的代谢性疾病[1]*。大约5%～12%的高尿酸血症最终会发展为痛风，还与糖尿病、中风等多种疾病相关[2-4]*。然而，目前市面上销售的治疗高尿酸血症的药物有一些副作用，限制了其临床应用。例如，别嘌呤醇的副作用包括胃肠道刺激、骨髓抑制、过敏综合征、肝炎和肾功能恶化[5-6]*。越来越多的天然产品，如金枪鱼提取物[7]*、乳清蛋白肽[8]*等已被证明对高尿酸血症的控制有效且不良反应小，在高尿酸血症治疗中具有显著优势。

汉麻仁含有30%以上的油脂和25%以上的蛋白[9]*。汉麻仁蛋白中含量最高的氨基酸是谷氨酸（3.74%～4.58%），其次是精氨酸（2.28%～3.10%）。除赖氨酸和含硫氨基酸外，各种必需氨基酸均满足FAO/WHO对2～5岁婴幼儿的建议要求，是一种优质的蛋白质[10-11]*。汉麻仁还富含被认为是潜在的抗高血压药物的肽[12]*和具有潜在抗炎和心血管活性的木脂素酰胺[13]*。最近的研究发现汉麻仁还可以降低肥胖Zucker大鼠血浆尿酸水平[14]*，但其在治疗高尿酸血症的功能作用和机制尚未完全阐明。

斑马鱼作为新型模式生物，与人类有高达70%以上基因同源，且有成本低、用药量少等多种优点，可以高通量地进行活性物质筛选[15-16]*，具有成为优良高尿酸模型的潜力[17]*。次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine-phosphoribosyltransferases，HPRT）是嘌呤代谢补救合成途径中的一种关键酶[18]*。有机阴离子转运蛋白1（Organic anion transporter 1，OAT1）是SLC22A转运蛋白家族的一员，在介导肾脏尿酸盐分泌到尿液中发挥作用[19]*。因此，本研究通过将汉麻仁脱脂粉配制成500，1 000和2 000 μg/mL的3种不同质量浓度的水溶液饲养高尿酸斑马鱼幼鱼模型，分析汉麻仁脱脂粉对斑马鱼幼鱼的最大耐受浓度（Maximum tolerance concentration，MTC）及降尿酸功效和匀浆中相关基因表达水平，进而研究汉麻仁脱脂粉辅助降尿酸功效和潜在机制，为汉麻仁脱脂粉在功能食品中的应用提供理论数据[20-21]*。

1 材料与方法

1.1 动物试验

野生型AB品系斑马鱼由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，斑马鱼胚胎在光照14 h、黑暗10 h的循环水系统中以自然成对交配繁殖方式获得。斑马鱼饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450～550 μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO3），试验动物使用许可证号为SCXK（浙）2022-0004。饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号：001458）的要求。发育至受精后5天（5 days post-fertilization，5dpf）的斑马鱼用于样品辅助降尿酸功效最大耐受浓度（MTC）测定、功效评价和辅助降尿酸功效机制研究。

1.2 材料与试剂

汉麻仁脱脂粉，为实验室经超微粉碎后采用超临界提取自制，用标准稀释水配制成10.0 mg/mL母液，现配现用；AmplexTM*Red Uric Acid/Uricase Assay Kit[批号2286863，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，USA]；氧嗪酸钾（批号为C1808048，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China），用含0.1%羧甲基纤维素的标准稀释水配制成20 mmol/L母液，现配现用；黄嘌呤钠盐（批号为SLBV3159，Sigma，USA），用标准稀释水配制成10 mmol/L母液，现配现用；别嘌呤醇（批号为MKCM1316，Sigma，USA），用100%DMSO配成13.6 mg/mL母液，-20 ℃保存；二甲基亚砜（DMSO，批号BCCD8942，Sigma，Switzerland）；无水乙醇（批号20210529，国药集团化学试剂有限公司，China）；iTaq Universal SYBR Green Supermix（货号1725124，Bio-rad，USA）；FastQuant RT Kit试剂盒[货号KR106-02，天根生化科技（北京）有限公司，China]；RNA-Quick Purification Kit（RNA快速提取试剂盒）（货号RN001，上海奕杉生物，China）。

1.3 仪器与设备

SZX7解剖显微镜（OLYMPUS，Japan）；CP214精密电子天平（OHAUS，USA）；703001型6孔板（Nest Biotech，China）；T100普通PCR扩增仪（Bio-rad，Singapore）；CFX Connect荧光定量PCR仪（Bio-rad，Singapore）；PICO17/21高速冷冻离心机（ThermoFisher，Germany）；Nanodrop2000紫外-可见光分光光度计（Thermo，Austria）；BE-6100微孔板迷你离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，China）。

1.4 方法

1.4.1 汉麻仁脱脂粉制备流程

汉麻籽→脱壳→CO2超临界萃取3次→超微粉碎（0.150 mm）→汉麻仁脱脂粉

1.4.2 汉麻仁脱脂粉主要成分分析方法

蛋白质含量测定：GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[22]*。

脂肪含量测定：GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[23]*。

碳水化合物含量测定：GB/Z 21922—2008《食品营养成分基本术语》[24]*。

水分含量测定：GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[25]*。

1.4.3 最大检测耐受浓度（MTC）测定

将240尾5dpf正常发育的斑马鱼随机分为正常对照组、模型对照组和含五种质量浓度（125，250，500，1 000，2 000和4 000 μg/mL）的汉麻仁脱脂粉的实验组于含3 mL标准稀释水（pH约为7.8±0.2，硬度约为250 mg/L，以CaCO3计）6孔板中，每组30尾。

除正常对照组外，其余各试验组均以终浓度为0.5 mmol/L的黄嘌呤钠盐和10 mmol/L的氧嗪酸钾水溶液联合诱导斑马鱼高尿酸模型。试验组斑马鱼的标准稀释水中除含有氧嗪酸钾和黄嘌呤钠盐外，另含有不同浓度的汉麻仁脱脂粉。正常对照组不作任何药物处理。置于28 ℃恒温培养箱中20 h后，观察各试验组斑马鱼幼鱼各靶器官的毒性及死亡情况，对各试验组斑马鱼幼鱼各靶器官无毒性且不会导致斑马鱼幼鱼死亡的样品浓度即为该样品的MTC。将MTC作为最高剂量，并依次3倍递减确定中剂量组和低剂量组给药浓度。

1.4.4 辅助降尿酸功效评价方法

样品配制方法同1.4.3小节。将180尾5dpf正常发育的斑马鱼随机分为正常对照组、模型对照组、别嘌呤醇组、和含3种质量浓度（500，1 000和2 000 μg/mL）的汉麻仁脱脂粉试验组，每组30尾。

阳性对照组饲养斑马鱼的标准稀释水中除含有氧嗪酸钾和黄嘌呤钠盐外，另含有别嘌呤醇136 μg/mL。各组斑马鱼在恒温28.5 ℃的培养箱中饲养20 h后，于30 mL的预冷至0 ℃的0.9%氯化钠中均质，4 ℃匀浆，10 000 r/min离心10 min，取上清液利用AmplexTM*Red Uric Acid/Uricase Assay Kit尿酸荧光检测试剂盒，使用多功能酶标仪软件采集数据，激发波长530～560 nm，发射波长590 nm，分析斑马鱼体内（匀浆）尿酸荧光信号强度。

1.4.5 降尿酸基因研究方法

样品配制方法同1.4.3小节，各试验组斑马鱼给药方式同1.4.4小节。28 ℃处理20 h后，使用RNA快速提取试剂盒提取各组均质化斑马鱼总RNA，利用紫外-可见光分光光度计对总RNA浓度和纯度进行测定。取2.00 μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20.0 μL cDNA，通过q-PCR检测β-actin、HPRT1和OAT1基因的表达。

1.5 数据统计方法

统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS 26.0软件进行统计学分析，单因素方差分析采用t检验和方差分析，P＜0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 汉麻仁脱脂粉主要成分分析结果

汉麻仁脱脂粉中的主要成分为蛋白质，其含量为70.3 g/100 g，其次为碳水化合物14.6 g/100 g，脂肪含量为5.2 g/100 g，相对汉麻仁脂肪含量降低很多。CO2超临界萃取能有效地提取汉麻仁里的油脂。

表1 汉麻仁脱脂粉主要成分含量表 单位：g/100 g

2.2 汉麻仁脱脂粉的最大耐受浓度（MTC）

由表2可知，在试验条件下，当汉麻仁脱脂粉浓度最高为2 000 μg/mL时，对斑马鱼幼鱼各靶器官无毒性且不会导致斑马鱼死亡，汉麻仁脱脂粉对模型斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）为2 000 μg/mL。选择了样品低剂量500 μg/mL、中剂量1 000 μg/mL、高剂量2 000 μg/mL，进行汉麻仁脱脂粉辅助降尿酸功效评价试验。

表2 汉麻仁脱脂粉最大检测浓度（n=30）

2.3 汉麻仁脱脂粉辅助降尿酸功效评价结果

由表3和图1可知，与正常对照组比较，模型对照组斑马鱼尿酸荧光信号强度显著增高（P＜0.05），斑马鱼高尿酸模型建立成功，与模型对照组比较，低剂量组500 μg/mL斑马鱼尿酸荧光信号增强，是因为试验中尿酸的检测原理是检测尿酸反应后的过氧化氢浓度，500 μg/mL质量浓度斑马鱼试验中产生过氧化氢，数值就会比模型组略高，但无统计学差异，中剂量1 000 μg/mL组比模型组斑马鱼尿酸荧光信号降低但无统计学差异、高剂量2 000 μg/mL斑马鱼尿酸荧光信号强度降低，差异显著（P＜0.05）。

表3 汉麻脱脂粉的辅助降尿酸活性（n=3）

图1 样品处理后斑马鱼尿酸荧光信号强度

2.4 RNA提取结果及引物序列信息

样品处理结束后，提取斑马鱼总RNA，用紫外-可见光分光光度计测定RNA的浓度及A260/A280比值（表4），A260/A280比值均在1.8～2.2之间，表明提取得到斑马鱼总RNA质量较好，可用于后续q-PCR试验。引物序列见表5。

表4 总RNA的浓度及A260/A280比值（n=30，样本一）

表5 引物序列信息

2.5 定量PCR检测

汉麻脱脂粉对高尿酸模型斑马鱼中HPRT1和OAT1基因表达的影响如表6、图2和图3所示与模型对照组，汉麻仁脱脂粉中剂量组1 000 μg/mL提高了HPRT1相对表达（P＜0.05），高剂量组2 000 μg/mL对HPRT1相对表达不显著，推测是2 000 μg/mL质量浓度组基因表达比较快，在检测的时间点已经过了高峰，基因表达下降了。汉麻仁脱脂粉对OAT1相对表达无显著差异。

表6 样品辅助降尿酸功效机制研究相关基因表达的影响（n=3）

图2 HPRT1和OAT1基因相对表达量

3 结论

汉麻仁脱脂粉对模型斑马鱼的MTC为2 000 μg/mL，与模型对照组状态相似，汉麻仁脱脂粉具有辅助降低给予氧嗪酸钾和黄嘌呤钠盐建立高尿酸模型斑马鱼体内尿酸的功效，分析其原因与通过上调HPRT1（次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因）基因的表达有关。随着生活水平的提高，人们的饮食习惯也产生很大的改变，如高嘌呤物质的摄入，患上高尿酸血症、痛风的人群越来越大。目前针对此类疾病的治疗药物存在较大的毒副作用，促使人们从安全的自然产物中挖掘新的有效的降尿酸活性物质，以便改善和治疗高尿酸血症、痛风疾病[26]*。汉麻仁脱脂粉是目前尚未被充分利用的一类低值完美蛋白资源之一。研究为汉麻仁脱脂粉在辅助降尿酸功能和特医食品的开发利用提供技术基础，为汉麻仁的高值利用提供有效途径。同时为证明汉麻仁脱脂粉中起辅助降尿酸作用主要成分，下一步将对汉麻仁脱脂粉中蛋白质降尿酸功效进行研究。