变叶榕根总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究

习丹，陈明，吴文明，张菁华，陈途*

1. 江西省人民医院（南昌医学院第一附属医院）药学部（南昌 330006）；

2. 咸宁市公共检验检测中心（咸宁 437100）；3. 咸宁市中医医院（咸宁 437100）

变叶榕（Ficus variolosa）属双子叶植物桑科（Moraceae）榕属植物，产自我国浙江、江西、福建、广东（及沿海岛屿）、广西、湖南、贵州、云南东南部及南部，常生于溪边林下潮湿处。越南、老挝也有分布[1]*。据《浙江植物志》记载，茎清热利尿，叶敷跌打损伤，根亦入药，补肝肾，强筋骨，祛风湿等功效。从桑科榕属植物中分离得到的化合物有三萜类化合物、黄酮类化合物、倍半萜、香豆素、生物碱、甾醇等[2]*。对变叶榕较为系统的化学成分研究还不多见。试验采用微波辅助提取，利用高频电磁波加速细胞破裂，促进黄酮类物质溶出，进一步优化总黄酮提取工艺，并考察其体外抗氧化活性，为变叶榕总黄酮高效提取及进一步研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

变叶榕根（采自江西省资溪县，经江西省人民医院药学部副主任应萍鉴定为正品）。芦丁对照品（纯度＞98%，R189033-5 g，Aladdin）；亚硝酸钠（S818033-500 g，麦克林）；氢氧化钠（2110281，西陇科学）；硝酸铝（A800886-500 g，麦克林）；2, 2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（d6132-1 g，麦克林）；2, 2-联苯基-1-苦基肼基（D141336-250 mg，Aladdin）；过二硫酸钾（2107162，西陇科学）；铁氰化钾（P111564-100 g，Aladdin）；L（+）-抗坏血栓（2110142，西陇科学）；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

NP80 touch型超微量分光光度计（德国Implen公司）；CW-2000型超声微波协同萃取仪（上海亚荣生化仪器厂）；RE-2000B型旋转蒸发仪、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；HH·SII-Z-S型电热恒温水浴锅（上海新苗医疗器械制造有限公司）；FBC1002型超纯水机（青岛富勒姆科技有限公司）；Mettler AE240电子天平（万分之一，美国梅特勒-托利多仪器公司）；DZF-6050AB真空干燥箱（邦西仪器科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

变叶榕根样品放入恒温干燥箱内60 ℃烘干至恒重，粉碎，过0.250 mm孔径（60目）筛，收集粉末，备用。

1.3.2 总黄酮提取工艺

精密称取1.00 g供试品粉末于50 mL圆底烧瓶中，分别在不同的乙醇体积分数、微波功率、提取时间和料液比因素的条件下提取，减压过滤提取液，用旋转蒸发仪进行旋转制成浸膏，按照配比加入乙醇溶解，用离心机进行离心，得到的溶液定容到容量瓶中，再进行稀释，配成待测溶液，测定其吸光度，计算提取率。

1.3.3 总黄酮含有量测定

1.3.3.1 线性关系考察[3]*

精密称取26.47 mg芦丁标准品，加适量75%乙醇溶解并定容至50 mL，作为储备液。用移液管精密取0，0.25，0.50，1.00，1.25和1.50 mL储备液分别置于10 mL量瓶中，加0.4 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀静置6 min，加入0.4 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀静置6 min，加4 mL 4%氢氧化钠溶液，加无水乙醇定容，摇匀放置15 min。在510 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程A=0.008 3X-0.029 2（R2*=0.996 3），在0～79 μg/mL范围内线性关系良好。

1.3.3.2 提取率测定

提取率按式（1）计算。

1.3.3.3 重复性试验[4]*

配制0.1 mg/mL芦丁对照品溶液，于0，2，4，6，8和10 h测定吸光度，测得其SRSD为0.192%，表明该方法重复性良好。

1.3.3.4 精密度试验

0.1 mg/mL芦丁对照品溶液，连续测定吸光度6次，测得其SRSD为0.283%，表明仪器精密度良好。

1.3.3.5 加样回收率试验

取10 mL 0.053 94 mg/mL提取液，共9份，置于50 mL量瓶中，加入10 mL 0.061，0.053和0.042 mg/mL芦丁对照品溶液，共3份，用75%乙醇定容，测定吸光度，计算加样回收率。结果显示，3份溶液的回收率分别为99.4%，98.7%和99.8%，SRSD为0.96%。

1.3.4 单因素试验

以变叶榕根总黄酮提取率为指标，在固定其他试验条件的情况下，分别考察乙醇体积分数、微波时间、微波功率、料液比对变叶榕根总黄酮提取率的影响。用紫外分光光度计测定提取液中总黄酮含量，根据变叶榕根中总黄酮提取率，考察分析微波萃取中的单个因素影响。

1.3.4.1 微波功率

固定样品粉末用量1.0 g、乙醇体积分数60%、料液比1∶40（g/mL）、微波时间20 min，选择微波功率200，300，400，500和600 W，取1 mL，按1.3.3.1的方法稀释到10 mL，测定吸光度。

1.3.4.2 微波时间

固定样品粉末用量1.0 g、乙醇体积分数60%、料液比1∶40（g/mL）、微波功率500 W，选择微波时间5，10，15，20和25 min，取1 mL，按1.3.3.1的方法稀释到10 mL，测定吸光度。

1.3.4.3 料液比

固定样品粉末用量1.0 g、乙醇体积分数60%、料液比1∶40（g/mL）、微波功率500 W、微波时间20 min，选择料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），取1 mL，按1.3.3.1的方法稀释到10 mL，测定吸光度。

1.3.4.4 乙醇体积分数

固定样品粉末用量1.0 g、料液比1∶40（g/mL）、微波功率500 W、微波时间20 min，选择乙醇体积分数40%，50%，60%，70%和80%，取1 mL，按1.3.3.1的方法稀释到10 mL，测定吸光度。

1.3.5 响应面法优化[5]*

在单因素试验基础上，进一步对4个单因素条件（乙醇体积分数、液料比、微波功率、微波提取时间）进行考察，以总黄酮提取率为响应指标，应用Design-Expert 13.0.1.0软件，优化试验条件。

1.3.6 抗氧化活性测定

1.3.6.1 药液配制

将最优条件下得到的提取液在50～55 ℃下浓缩至2.01 mg/mL，用75%乙醇依次稀释至5.00，10.00，15.00，20.00和25.00 μg/mL，并配制相同质量浓度维生素C、芦丁溶液作为对照，冷藏备用。

1.3.6.2 对DPPH·的清除能力

参照Yu等[6]*报道的方法，略有改动。精密吸取100 μL不同质量浓度的样品溶液（6.25，12.5，25，50和100 μg/mL），加入100 μL的100 μg/mL DPPH溶液，充分混匀后，避光，于37 ℃反应30 min，于酶标仪在517 nm处测定吸光度As。同时设定溶剂空白组（An，DPPH溶液用等体积甲醇代替）和样品空白组（A0，样品溶液用等体积甲醇代替）。以VC为阳性对照。试验重复3次。按式（2）计算各组分对DPPH·清除率，并依此计算IC50值。

1.3.6.3 对ABTS+*·的清除能力[7]*

参照王荣等[7]*报道的方法。避光称取15 mg ABTS自由基粉末，加4 mL超纯水溶解，得7.0 mmol/L的ABTS水溶液。称取5 mg K2S2O8加7.5 mL超纯水溶解，将以上2种溶液按体积比1∶1等量混合，制备ABTS+*·母液，置于4 ℃冰箱保存10～12 h，备用。使用时，用无水乙醇稀释至吸光度在0.7±0.02范围内即可。将各组分的母液用无水乙醇稀释成不同质量浓度的样品溶液（6.25，12.50，25.00，50.00和100.00 μg/mL）。以100 μL各组分样品溶液和100 μL ABTS+*·水溶液为试验组，对照组为100 μL无水乙醇代替ABTS+*·水溶液，以加入100 μL ABTS+*·水溶液和100 μL无水乙醇为标准组，每个浓度设置3个复孔。避光反应30 min，用酶标仪在734 nm下测定吸光度。以VC为阳性对照。上述试验重复3次。按式（2）计算ABTS+*·清除率，计算IC50值。

1.3.6.4 对 Fe3+*还原能力

参照Mazor等[8]*与朱伟等[9]*报道的方法，取0.8 mL不同质量浓度的样品溶液（6.25，12.50，25.00，50.00和100.00 μg/mL），加入2 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和2 mL 1%铁氢化钾，于50 ℃水浴20 min，加2 mL 10%三氯乙酸，以3 000 r/min离心10 min，取2 mL上清液加2 mL去离子水、0.4 mL 0.1%三氯化铁，反应5 min，于700 nm测吸光度，以VC为阳性对照，试验平行操作3次，测得的吸光度越大表示还原能力越强[10]*。

还原力试验的原理是样品将铁氢化钾还原成亚铁氢化钾，亚铁氰化钾与铁离子作用，生成普鲁士蓝，在700 nm波长处测定吸光度，吸光度越大，表明其对Fe3+*还原的活性越强。吸光度0.5时的样品浓度，即为IC50值，IC50值越小表示样品还原能力越强[11]*。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 微波功率[12]*

图2显示，总黄酮提取率随着微波功率升高而先升高后降低，其原因是微波离子传导作用可随其功率增大而增强，促使变叶榕根细胞膜膨化、破裂，总黄酮在功率500 W时全部溶出，继续增大微波功率，不但损耗能量，黄酮提取率还会随之下降，可能是热效应导致黄酮分解[13]*，故确定微波功率为500 W。

图2 微波功率对总黄酮提取率的影响

2.1.2 微波时间

图3显示，微波提取时间小于20 min时，总黄酮提取率随着时间延长热效应逐渐加强，释放量随之增大，20 min时最高，表明该成分已完全释放。25 min时，提取率迅速下降，主要是由于过量热效应可使总黄酮分解，故确定微波时间为20 min。

图3 微波时间对总黄酮提取率的影响

2.1.3 料液比

提取溶液料液比对提取率产生影响，选取合适的料液比可以增加黄酮的提取量[14]*。图4显示，随着料液比中乙醇用量增加，总黄酮逐渐被溶出，提取率逐渐增加。但其过量时，反而会因杂质溶出而导致总黄酮提取率下降，故确定料液比为1∶40（g/mL）。

图4 料液比对总黄酮提取率的影响

2.1.4 乙醇体积分数

图5显示，乙醇体积分数小于60%时，总黄酮提取率随着其升高而增加，并在60%时达到溶解平衡，提取率最高。大于60%时，过量渗透压会将变叶榕根中杂质溶出，提取率反而下降，故确定乙醇体积分数为60%。

图5 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

2.2 响应面优化变叶榕根黄酮的提取工艺

2.2.1 因素水平设计

通过Design-Expert 13.0.1.0软件分析，以总黄酮提取率为评价指标（Y）进行优化[15]*，因素水平设计见表1，结果见表2。回归方程为Y=17.64+0.24A-0.69B+0.18C+0.29D-0.067AB+0.005AC-1.41AD-0.095BC+0.56BD-0.59CD-0.69A2*-1.75B2*-0.82C2*-1.98D2*。

表1 响应面因素水平设计

2.2.2 响应面优化设计试验结果及方差分析

Box-Behnken试验设计及试验结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及试验结果

方差分析见表3。由此可知：模型P＜0.000 1，表明模型显著；失拟项P＞0.05，表明模型失拟性不显著；R2*为0.990，表明模型回归显著，准确度高；Radj2*为0.981，表明总黄酮提取率与各因素之间相关度较高；C.V.仅为1.29%，表明模型可靠性高；模型F值与变量对响应值影响呈正比[16]*，故各因素影响程度依次为微波时间（B）＞乙醇体积分数（D）＞微波功率（A）＞料液比（C），与单因素试验结果一致；两因素相互作用影响程度依次为AD＞CD＞BD＞BC＞AB＞AC。响应面分析见图6～图11。

图1 芦丁标准曲线

图6 微波功率（A）和微波时间（B）交互作用对提取率的影响

图11 料液比（C）和乙醇体积分数（D）交互作用对提取率的影响

表3 方差分析

图7 微波功率（A）和料液比（C）交互作用对提取率的影响

图8 微波功率（A）和乙醇体积分数（D）交互作用对提取率的影响

图9 料液比（C）和微波时间（B）交互作用对提取率的影响

图10 乙醇体积分数（D）和微波时间（B）交互作用对提取率的影响

2.3 验证试验

最优工艺为乙醇体积分数59.3%、料液比1∶41.4（g/mL）、微波功率525.7 W、微波时间18.9 min，此时总黄酮提取率为1.77%。结合实际生产操作，将其修正为微波功率500 W、微波时间20 min、乙醇体积分数60%、料液比1∶40（g/mL），其他条件不变。开展3批验证试验，测得总黄酮平均提取率为1.771%，接近预测值1.774%，表明模型拟合情况良好。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 对DPPH·的清除能力

图12显示，随着提取物质量浓度的增大，变叶榕根总黄酮和VC对DPPH·的清除能力逐渐上升，但均低于VC，在100 μg/mL时达到最大值，自由基清除率为总黄酮96.83%、VC 99.22%，且在高浓度时变叶榕根总黄酮清除率与VC相当。总黄酮的IC50值25.62 μg/mL，阳性对照VC的IC50值8.47 μg/mL。从而可以证明，变叶榕根总黄酮具有良好的抗氧化活性，其活性随浓度升高而增强。

图12 不同浓度总黄酮提取物对DPPH·的清除率

2.4.2 对ABTS·的清除能力

图13显示，总黄酮随着质量浓度升高对ABTS·的清除能力也随之加强，在低质量浓度下与VC差距较大，在质量浓度高于12.5 μg/mL时，总黄酮清除率迅速升高逐渐接近VC，总黄酮的IC50值6.99 μg/mL，阳性对照VC的IC50值2.31 μg/mL。与DPPH·比较，总黄酮对 ABTS·的清除能力相对较强，在质量浓度均低于25.00 μg/mL时明显高于对DPPH·的清除能力。

图13 不同浓度总黄酮提取物对ABTS·的清除率

2.4.3 还原能力测定结果

还原力试验的原理是样品将铁氢化钾还原成亚铁氢化钾，亚铁氰化钾与铁离子作用，生成普鲁士蓝，在700 nm波长处测定吸光度，吸光度越大，表明其对Fe3+*还原的活性越强。吸光度0.5时的样品浓度，即为IC50值，IC50值越小表示样品还原能力越强[17]*。

如图14所示，在6.25～100 μg/mL浓度的范围内，变叶榕根总黄酮对Fe3+*还原活性随着浓度的增加活性增强。总黄酮的IC50值大于100 μg/mL，阳性对照VC的IC50值48.26 μg/mL。由此可见，变叶榕根总黄酮对Fe3+*还原活性明显低于VC。

图14 不同浓度总黄酮提取物对Fe3+*的还原能力

3 结论

试验所得最优变叶榕根总黄酮微波辅助提取工艺为乙醇体积分数60%、料液比1∶40（g/mL）、微波功率500 W、微波时间20 min，此时总黄酮提取率为1.77%，接近于预测值，表明工艺准确可靠。变叶榕根总黄酮提取液对DPPH·、ABTS·均有较强的清除能力，在质量浓度高于20 μg/mL仅略低于VC，对Fe3+*还原活性明显低于VC。综上所述，变叶榕根总黄酮具有较强的抗氧化能力，表明该植物可作为天然抗氧化剂应用于食品、保健品等行业，开发前景广阔。