没药中2 个新倍半萜类化合物

梁乃允，黄惠铭，王超超，裴钰洁，王勃开，杜 梦，霍会霞，宋月林，郑 姣，赵云芳*，李 军,*

1.北京中医药大学中药学院，北京 100029

2.北京中医药大学 北京中医药研究院 中药现代研究中心，北京 100029

没药为橄榄科（Burseraceae）没药属CommiphoraJacq.植物地丁树Commiphora myrrhaEngl.或哈地丁树C.molmolEngl.的干燥树脂，分为天然没药和胶质没药，其味辛、苦，性平，具有散瘀定痛、消肿生肌等功效，用于胸痹心痛、胃脘疼痛、痛经经闭等病症[1]。没药在我国传统医学药用历史悠久，常与乳香相须入伍使用，常见复方应用有七厘散、西黄丸、天和追风膏、活血壮筋丸等。近年来，国内外学者对没药的化学成分和药理活性进行大量的研究工作，其化学成分主要包括萜类、甾体类、木脂素类、黄酮类[2]等，药理活性包括细胞毒[3]、抗炎镇痛、抗氧化抗菌[4]、保肝[5]等。本课题组前期从没药的正己烷提取部位中分离鉴定了倍半萜及其二聚体[3,6]，为了进一步阐明没药的化学成分，本研究继续对其正己烷提取部位进行化学成分研究，分离鉴定了8 个倍半萜类化合物，分别为(4R,5S)-呋喃杜松-6(1),7(8),9(10)-三烯-5-醇乙酸酯[(4R,5S)-furanocadina-6-(1),7(8),9(10)-triene-5-ol acetate，1]、(1E,3S,4R,8S)-吉玛-3-甲氧基-8-羟基-1,10(15),7(11)-三烯-6-羰基-8,12-内酯 [(1E,3S,4R,8S)-germacra-3-methyoxy-8-hydroyl-1,10(15),7(11)-trien-6-oxo-8,12-olide，2]、gajutsulactone A（3）、1-hydroxyeudesma-3,7(11)-dien-8-one（4）、1-hydroxyeudesma-4(14),7(11)-dien-8-one（5）、5β-10α-hydroxy-2α-methoxy-6-oxoguaia-7(11),8-dien-8,12-olide（6）、(2R,4R,5S)-2-甲氧基-5-乙酰基-呋喃吉玛-1(10)E-烯-6-酮 [(2R,4R,5S)-2-methyoxy-5-acetoxy-furanogermacr-1(10)E-en-6-one，7]、1(10)Z,4Z-蓬莪术二烯-6-酮 [1(10)Z,4Z-furanodiene-6-one，8]。其中化合物1 和2 为新化合物，化合物3～5 为首次从没药属植物中分离得到。化合物5 对人肝癌HepG2 细胞增殖具有明显的抑制作用，其半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）为（4.43±1.39）μmol/L。

1 仪器与材料

UH5300 型分光光度计；Nexus-470 FTIR 傅里叶变换红外光谱仪；Nicolet iS10 傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；高效液相-离子阱-飞行时间质谱仪（日本岛津公司）；Varian Inova-500型核磁共振仪（美国Varian 公司），AVANCE NEO 400 型核磁共振仪（德国 Bruker 公司）；岛津LC-20AT 半制备型高效液相（日本岛津公司）；Shimadzu LC-20AT 型半制备型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ZF-1 型三用紫外分析仪（江苏海门市其林贝耳仪器制造有限公司）；CAPCELL-pak-C18半制备HPLC 色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm）；旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）；柱色谱用硅胶（200～300 目）及薄层色谱用GF254硅胶预制板均为青岛海洋化工厂生产，ODS（40～63 μm，德国Merck公司），SephadexTMLH-20（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB 公司）；提取分离所用石油醚、正己烷、二氯甲烷、醋酸乙酯、无水乙醇、甲醇等试剂为西陇科学股份有限公司生产，均为分析纯。高效液相所用溶剂（甲醇、乙腈）为色谱纯，水为超纯水。

没药于2018 年12 月购自北京市华邈药业有限公司，由北京中医药大学中药现代研究中心屠鹏飞教授鉴定为地丁树C.myrrhaEngl.的干燥树脂，样品标本（DD4271）存放于北京中医药大学中药现代研究中心。

2 方法

2.1 提取与分离

没药（3.0 kg）粉碎后，依次用正己烷、二氯甲烷、95%乙醇回流提取（2×10 L，每次2 h），分别合并提取液，减压回收溶剂得到正己烷提取物651.0 g、二氯甲烷提取物511.0 g、95%乙醇提取物90.0 g。

正己烷提取物525.0 g 经硅胶柱色谱分离，正己烷-醋酸乙酯（1∶0～0∶1）梯度洗脱得到21 个流分（Fr.A～U）。Fr.D（7.0 g）采用硅胶柱色谱分离，正己烷-二氯甲烷（2∶1～0∶1）梯度洗脱，得到5个流分（Fr.D1～D5）。Fr.D1 经硅胶柱色谱分离，正己烷-二氯甲烷（5∶1～0∶1）梯度洗脱，得到5个流分（Fr.D1a～D1e）。Fr.D1g 经 Sephadex LH-20柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱，得到6个流分（Fr.D1g1～D1g6），Fr.D1g3 用半制备液相（乙腈-水55∶45）纯化得到化合物2（tR=27.0 min，3.9 mg）。Fr.E（5.2 g）经硅胶柱色谱分离，正己烷-醋酸乙酯（80∶1～0∶1）梯度洗脱得到14 个流分（Fr.E1～E14）。Fr.E2 经硅胶柱色谱分离，正己烷-醋酸乙酯（80∶1）等度洗脱得到化合物6（5.2 mg）。Fr.E9 经硅胶柱色谱分离，石油醚-醋酸乙酯（60∶1）等度洗脱得到化合物3（4.6 mg）。Fr.E14 经硅胶柱色谱分离，正己烷-醋酸乙酯（80∶1～0∶1）梯度洗脱得到11 个流分（Fr.E14a～E14k）。Fr.E14k经半制备液相（乙腈-水40∶60）纯化得到化合物5（tR=27.0 min，8.2 mg）和4（tR=29.5 min，5.4 mg）。Fr.G（16.0 g）经ODS 柱色谱，甲醇-水（70∶30～100∶0）梯度洗脱得到17 个流分（Fr.G1～G17）。Fr.G9 有不溶物析出，甲醇洗涤后得化合物7（10.2 mg）。Fr.G6 经硅胶柱色谱分离，正己烷-醋酸乙酯（20∶1～0∶1）梯度洗脱得到10 个流分（Fr.G6a～G6j）。Fr.G6j 经硅胶柱色谱分离，正己烷-醋酸乙酯（30∶1）等度洗脱得到化合物8（5.6 mg）。Fr.L（15.0 g）经ODS 柱色谱，甲醇-水（70∶30～100∶0）梯度洗脱得到17 个流分（Fr.L1～L17）。Fr.L2 经硅胶柱色谱分离，正己烷-醋酸乙酯（10∶1～0∶1）梯度洗脱得到11 个流分（Fr.L2a～L2k）。Fr.L2f经半制备液相（乙腈-水45∶55）纯化得到化合物1（tR=44.0 min，2.0 mg）。

2.2 化合物1 和2 的化学计算

对化合物1 和2 的计算ECD 实验包括构象分析、图谱计算和图谱拟合3 个步骤。首先利用Chemdraw 3D对化合物1和2进行能量最小化操作，得到初始构象；接着采用Sybyl 2.0 软件进行优势构象搜索，选择能量≤最小能量+6 的构象。利用Gaussian 软件，根据密度泛函理论DFT，采用密度函数B3LYP 和6-31G 基组，CPCM 模型对其进行进一步结构优化，再结合较大基组（6-31G，d）计算每个构象的ECD 图谱。最后分析数据，拟合图谱。用SpecDis 软件打开化合物1 和2 每个构象的ECD图谱，根据每个构象的玻尔兹曼权重因子，将所有能量分部率符合的构象按照玻尔兹曼能量分布进行拟合、生成图谱并与化合物1 和2 的实验图谱比较，确定化合物1 和2 的绝对构型[7]。计算NMR 时，采用GIAO 方法，计算时采用的泛函与基组为B3LYP/6-31G（d，p），并搭配CPCM 甲醇的溶剂模型，对化合物的核磁共振碳原子的屏蔽常数值进行计算，将计算结果利用DP4+可能性分析方法分析其与实验数据之间的可能性百分比，从而确定化合物结构[8]。

3 结构鉴定

图1 化合物1 的结构和关键的HMBC、1H-1H COSY 和NOESY 相关Fig.1 Structure and key HMBC,1H-1H COSY and NOESY correlations of compound 1

图2 化合物1 的实验ECD 和计算ECD 图谱Fig.2 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

表1 化合物1 和2 的核磁共振氢谱 (500/400 MHz) 和碳谱 (125/100 MHz) 数据 (CDCl3)Table 1 1H-NMR (500/400 MHz) and 13C-NMR (125/100 MHz) data of compounds 1 and 2 in CDCl3

图3 化合物2 的结构和关键的HMBC、1H-1H COSY 和NOESY 相关Fig.3 Structure and key HMBC,1H-1H COSY and NOESY correlations of compound 2

图4 化合物2 的实验ECD 和计算ECD 图谱Fig.4 Experimental and calculated ECD spectra of compound 2

化合物3：无色油状物，ESI-MSm/z: 235.18 [M+H]+，分子式为C15H22O2。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 4.76 (1H,m,H-9a),4.75 (1H,m,H-9b),2.47 (1H,d,J=13.0 Hz,H-6a),2.26 (1H,ddd,J=8.0,8.0,8.0 Hz,H-1),2.20 (3H,m,H-13),2.14 (1H,d,J=13.0 Hz,H-6b),2.05 (1H,m,H-5),1.94 (1H,m,H-3a),1.93 (1H,m,H-2a),1.86 (1H,m,H-3b),1.84 (3H,s,H-12),1.72 (3H,brs,H-14),1.68 (1H,m,H-2b),1.23(3H,s,H-15)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 167.5(C-8),152.4 (C-11),145.9 (C-10),119.8 (C-7),110.6(C-9),85.4 (C-4),47.6 (C-1),45.7 (C-5),36.8 (C-3),27.0 (C-6),26.8 (C-2),23.8 (C-13),23.5 (C-12),19.6(C-14),19.6 (C-15)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物3 为gajutsulactone A。

化合物4：无色油状物，ESI-MSm/z: 235.16[M+H]+，分子式为C15H22O2。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 5.37 (1H,m,H-3),3.61 (1H,dd,J=10.0,6.0 Hz,H-1),2.79 (1H,dd,J=15.2,4.8 Hz,H-2a),2.17 (1H,m,H-2b),2.61 (1H,dd,J=16.0 Hz,H-9a),2.21 (1H,dd,J=16.0 Hz,H-9b),2.01 (3H,s,H-13),1.85 (3H,s,H-12),1.68 (3H,s,H-14),0.83 (3H,s,H-15)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 202.6 (C-8),147.3 (C-11),134.3 (C-4),130.3 (C-7),120.7 (C-3),75.0 (C-1),52.1 (C-9),44.0 (C-5),38.6 (C-10),31.9(C-2),29.0 (C-6),23.9 (C-13),23.3 (C-12),20.7 (C-14),11.2 (C-15)。以上数据与文献报道基本一致[15-16]，故鉴定化合物4 为1-hydroxyeudesma-3,7(11)-dien-8-one。

化合物5：无色油状物，ESI-MSm/z: 235.16 [M+H]+，分子式为C15H22O2。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 4.90 (1H,brs,H-14a),4.63 (1H,brs,H-14b),3.54(1H,dd,J=11.8,4.6 Hz,H-1),2.71 (1H,dd,J=14.8 Hz,H-9a),2.21 (1H,dd,J=14.8 Hz,H-9b),2.00 (3H,s,H-13),1.82 (3H,s,H-12),0.75 (3H,s,H-15)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 203.1 (C-8),147.2(C-4),143.3 (C-11),130.9 (C-7),108.5 (C-14),78.2(C-1),53.8 (C-9),45.0 (C-5),42.6 (C-10),34.3 (C-3),31.5 (C-2),28.8 (C-6),23.4 (C-13),22.4 (C-12),11.1(C-15)。以上数据与文献报道基本一致[15-16]，故鉴定化合物5 为1-hydroxyeudesma-4(14),7(11)-dien-8-one。

化合物6：无色油状物，ESI-MSm/z: 231.12 [MH]-，分子式为C16H20O5。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 5.94 (1H,s,H-9),3.97 (1H,m,H-2),3.28 (3H,s,2-OCH3),2.85～2.79 (1H,m,H-4),2.36～2.32 (1H,m,H-1),2.36～2.32 (1H,m,H-5),2.30 (3H,s,H-13),2.02～1.97 (1H,m,H-3a),1.42～1.35 (1H,m,H-3b),1.40 (3H,s,H-14),1.07 (3H,d,J=7.2 Hz,H-15)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 193.7 (C-6),169.1(C-12),144.9 (C-7),139.3 (C-8),137.9 (C-11),121.5(C-9),82.3 (C-2),72.6 (C-10),60.4 (C-5),57.3 (C-1),56.5 (2-OCH3),39.2 (C-3),31.6 (C-4),22.7 (C-14),19.7 (C-15),11.1 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物6 为5β-10α-hydroxy-2αmethoxy-6-oxoguaia-7(11),8-dien-8,12-olide。

化合物7：白色粉末，ESI-MSm/z: 321.16 [M+H]+，分子式为C18H24O5。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 7.02 (1H,s,H-12),5.51 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5),5.21 (1H,d,J=9.6 Hz,H-1),4.12 (1H,m,H-2),3.63(1H,d,J=16.8 Hz,H-9a),3.30 (1H,d,J=16.8 Hz,H-9b),3.24 (3H,s,2-OCH3),2.36 (1H,m,H-4),2.02(3H,s,5-OCOCH3),1.94 (3H,s,H-15),1.91 (3H,s,H-13),1.89 (1H,m,H-3a),1.87 (1H,m,H-3b),1.07(3H,d,J=7.2 Hz,H-14)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 195.7 (C-6),170.5 (5-OCOCH3),154.5(C-8),137.8 (C-12),135.2 (C-10),132.8 (C-1),123.3(C-7),121.3 (C-11),79.2 (C-5),73.8 (C-2),56.0(2-OCH3),38.2 (C-9),37.9 (C-3),30.8 (C-4),20.8(5-OCOCH3),19.0 (C-15),17.4 (C-14),8.8 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物7 为(2R,4R,5S)-2-甲氧基-5-乙酰基-呋喃吉玛-1(10)E-烯-6-酮。

化合物8：白色粉末，ESI-MSm/z: 231.14 [M+H]+，分子式为C15H18O2。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 7.05 (1H,brs,H-12),5.84 (1H,brs,H-5),5.25 (1H,t,J=8.0 Hz,H-1),3.57 (1H,d,J=16.0 Hz,H-9a),3.03 (1H,d,J=16.0 Hz,H-9b),2.25 (2H,m,H-2),2.16 (3H,brs,H-13),1.79 (2H,m,H-3),1.73 (3H,brs,H-14),1.63 (3H,brs,H-15)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 193.6 (C-6),161.6 (C-8),141.0 (C-4),138.6(C-12),134.2 (C-10),129.2 (C-1),124.0 (C-5),123.0(C-7),121.5 (C-11),36.4 (C-2),32.9 (C-9),26.2(C-3),22.7 (C-14),19.3 (C-15),9.6 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[19]，故鉴定化合物8 为1(10)Z,4Z-蓬莪术二烯-6-酮。

4 生物活性测定

用MTT 法[20]测试化合物1～8 对人肝癌HepG2细胞增殖的影响。结果显示，化合物5 对HepG2细胞增殖具有较强的抑制作用，在40 μmol/L 浓度下对HepG2 细胞生长抑制率为（89.50±1.29）%，其IC50为（4.43±1.39）μmol/L [阳性对照药5-FU的IC50为（27.4±1.90）μmol/L]，化合物7 和8 具有一定的细胞增殖抑制活性，其在40 μmol/L 浓度下对 HepG2 细胞生长抑制率分别为（55.16±2.50）%、（51.00±6.90）%。化合物1～4 和6 对HepG2 细胞增殖无明显的抑制作用。

5 讨论

没药中含有丰富的萜类化合物，其中倍半萜类是主要成分，其结构类型丰富，主要包括吉马烷型、杜松烷型、桉叶烷型等。本研究利用多种色谱技术从没药中分离鉴定了8 个倍半萜类化合物，根据波谱数据和理化性质鉴定了它们的化学结构，其中1和2 为新化合物。本研究中分离得到的化合物结构类型多样，化合物1 为杜松烷型，化合物2、7 和8为吉马烷型，3 为榄烷型，4 和5 为桉叶烷型，6 为愈创木烷型，进一步丰富了没药的化学成分。利用MTT 法测试了所有单体化合物对人肝癌细胞系HepG2 增殖的影响，结果发现化合物5 具有较强的细胞增殖抑制活性，而与其结构相似的化合物4 未显示出明显的活性，比较二者结构，不同之处在于化合物5 具有末端双键，提示末端双键可能是其肿瘤细胞增殖抑制活性的关键基团。综上，本研究结果为阐释没药药效物质及其开发利用提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突