晚期肝癌免疫微环境CD38表达水平与PD-1抑制剂疗效相关性分析

孙小虎 王璐 白静慧 于洪

肝细胞癌(hepatic cellular cancer, HCC)是第三大癌症相关死亡原因，仅次于肺癌和胃癌[1,2]。目前多采用手术切除和肝移植的方法治疗早期HCC，但早期手术切除的5年生存率仍较低，且术后的复发率高达70%[3]。

目前，多激酶靶向抑制剂索拉非尼及乐伐替尼被用于晚期HCC的一线治疗，主要通过抑制血管内皮生长因子发挥作用[4]。随着研究的进展，免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICI)逐步被应用到晚期HCC的治疗中，如PD-1抑制剂纳武尤利单抗(nivolumab)等，但当前的临床试验显示仅有约20%的患者对治疗有反应[5]。研究表明，晚期HCC患者中CD38+免疫细胞的表达与预后有关[6]。本研究探索晚期HCC中CD38分子的表达水平与PD-1抑制剂治疗效果的相关性。

资料与方法

一、一般资料

选取2019年1月1日至2020年12月31日辽宁省肿瘤医院接受免疫治疗(PD-1抑制剂)晚期肝癌患者60例，其中男性43例，女性17例。纳入标准：①年龄18～70岁；②肝癌临床分期为III及IV期，已无手术指征；③既往未接受过免疫治疗(PD-1/PD-L1/CTLA-4抑制剂)；④无肝穿刺禁忌；⑤一般情况尚可，ECOG评分为0～1分，肝功能Child-Pugh为A或B级，预期寿命≥3个月；⑥治疗前临床资料完整。排除标准：①合并严重肝、肾损伤或自身免疫性疾病；②对本研究使用药物过敏的患者；③合并其他恶性肿瘤的患者；④门静脉主干或腔静脉存在癌栓的患者。所有患者签署相关知情同意书。本研究获得医院伦理委员会的批准。

二、生物信息学数据

从KM-plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/index.php?P=service)中搜索CD38在HCC中的信息，绘制相对于正常组织而言，CD38在HCC及晚期HCC中的生存分析曲线。

收集患者性别、年龄、甲胎蛋白(AFP)水平、当前PD-1抑制剂为几线治疗方案、是否为乙肝或丙肝患者、Child-Pugh分级、BCLC分期、ECOG评分、是否存在血管侵犯、既往是否行外科手术或介入治疗及影像学资料等。

所有患者在使用PD-1抑制剂前均进行血液检查包括血清胆红素、血浆白蛋白、凝血功能等，影像学检查包括原发肿瘤灶、腹水、转移情况。

三、肝穿刺活检

采用MyLab Twice(意大利)及Resona7型超声诊断仪进行超声定位下穿刺，检查前空腹8 h以上。患者取左侧卧位，常规消毒右侧腋前线9～10肋间隙，利多卡因局部麻醉，在超声引导下进针至肝包膜下1 cm处，使用一次性自动活检针迅速取肝组织1～2 cm，固定。每例患者多点取材(3-5次)。取同期手术切除HCC患者的癌旁组织10份作为对照。

四、 免疫组织化学检查

采用SP系列试剂盒进行免疫组织化学染色，石蜡切片脱蜡至水—蒸馏水冲洗—PBS浸泡5 min—抗原修复25 min—3%H2O2室温孵育—PBS冲洗—加入5%～10%山羊血清孵育10 min后加入一抗(鼠抗人CD38单克隆抗体，购自Santa Cruze公司，稀释为1∶100)4℃低温过夜—PBS冲洗—二抗37℃孵育10～20 min—PBS冲洗—添加标记好的链霉卵白素孵育10～30 min—PBS冲洗—DAB显色—苏木精复染。结果判读：将所有的染色切片在光镜下观察并进行图像采集。CD38表达于HCC癌巢中部分肿瘤细胞、间质细胞及细胞外基质。高倍镜下选取5个视野进行拍照记录。视野内未见浅黄色及棕黄色部分为CD38阴性(-)，视野内浅黄色阳性率在10%～30%为CD38弱阳性(+)，视野内浅黄色部分超过30%或棕黄色部分超过10%为CD38表达强阳性(++)，CD38(-)及CD38(+)为低表达，CD38(++)为高表达。

五、 PD-1抑制剂治疗

患者使用的PD-1抑制剂的种类不同，其中特瑞普利单抗12例，卡瑞丽珠单抗17例，信迪利单抗31例。特瑞普利单抗为每3周1次，每次240 mg，静脉滴注；卡瑞利珠单和信迪利单抗为每3周1次，每次200 mg，静脉滴注。

六、观察指标

主要观察指标为无进展生存期(progression-free survival, PFS)，次要观察指标为总生存期(overall Survival, OS)。治疗效果的评估采用mRECIST标准，完全缓解(complete response, CR)：患者所有目标病灶腹部CT示动脉期增强显影(目标病灶)均消失；部分缓解(partial response, PR)：腹部CT示目标病灶直径总和缩小≥30%；疾病稳定(stable disease, SD)：目标病灶缩小未达到PR或增大未达到PD；疾病进展(progressive disease, PD)：目标病灶的直径总和增大≥20%或出现新的病灶。患者每次入院接受治疗前均行腹部增强CT检查以评估疾病情况，记录6个疗程后的治疗效果。治疗有效=CR+PR+SD。治疗结束后随访时间至2021年10月1日。

七、 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。计数资料以例数表示，比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman检验，单因素分析采用Kaplan-Meier法，并绘制生存分析曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、CD38在肝癌组织中的表达

在KM-plotter数据库中，所有肝癌患者及晚期肝癌患者的CD38低表达均预示PFS更短(P<0.05)，如图1A和1B所示。本研究60例晚期肝癌患者肝癌组织中，CD38(-)21例，CD38(+)17例，CD38(++)22例；手术切除的HCC患者10份癌旁组织样本中CD38表达阴性0例，CD38(+)1例，CD38(++)9例；差异有统计学意义(χ2=10.126，P=0.006)。

二、CD38表达与PD-1抑制剂治疗效果的相关性

60例患者中，CD38低表达38例，高表达22例。6个治疗周期后，达到CR患者0例，PR患者6例[CD38(+)1例，CD38(++)5例]，SD患者15例[CD38(-)3例，CD38(+)5例，CD38(++)7例]，PD患者39例[CD38(-)20例，CD38(+)9例，CD38(++)10例]，治疗有效21例，无效39例。治疗有效患者中CD38低表达9例、高表达12例；治疗无效患者中CD38低表达29例，高表达10例，差异有统计学意义(χ2=5.833，P=0.016)。Spearman检测CD38表达与PD-1抑制剂治疗效果之间存在明显相关性(r=-0.404，P<0.05)。

三、 CD38表达与患者生存的关系

至随访期结束，60例患者中共有47例(78.33%)患者死亡，有8例(13.33%)患者出现疾病进展，5例(8.33%)患者疾病未进展，CD38高表达及低表达组的PFS及OS如图2A、B所示。

A：KM-plotter数据库中CD38在晚期HCC中的PFS生存曲线(n=88)；B：KM-plotter数据库中CD38在总HCC样本中的PFS生存曲线(n=366)；C癌旁正常组织CD38的表达情况；D：晚期HCC患者肝组织CD38的表达情况

A：CD38高表达患者与低表达患者OS曲线；B：CD38高表达与低表达患者PFS曲线

四、 影响晚期肝癌患者PFS的相关因素分析

单因素分析显示BCLC分期、Child-Pugh分级及CD38的表达可能与患者的PFS相关(P<0.05)，见表1所示。

表1 影响患者PFS的相关因素分析

讨 论

不同于细胞毒性治疗、小分子靶向抑制剂等治疗方式，免疫治疗可直接靶向肿瘤本身和肿瘤免疫微环境，是一种具有前景的新型治疗方法。PD-1/PD-L1/CTLA-4抑制剂在某些癌症的反应率相对较低，限制了其临床使用。可能与患者的肿瘤免疫微环境存在着明显差异有关。

机体正常T细胞上CD38的表达与其激活状态有关[7]。其在不同类型的肿瘤中表达不一，可通过促进能量代谢的方式促进鼻咽癌的进展[8]，也可以通过抑制肿瘤的能量代谢而抑制前列腺癌的进展[9]。在HCC中，CD38表达的增加与M1巨噬细胞的激活相关，这一过程的特点是CD80表达增加，IL-6及TNF-α的分泌增加，这些细胞因子有助于提高抗肿瘤免疫[10]。使CD38可作为HCC免疫治疗的一个潜在的靶点。

本研究结果显示，CD38发挥抑制HCC进展的作用，CD38高表达的患者具有更长的PFS。通过对比PD-1抑制剂治疗患者的CD38的表达水平，显示出CD38的水平与PD-1抑制剂治疗效果的相关性。对骨髓移植后的患者外周血淋巴细胞亚群分析显示，移植者外周血出现明显增多的CD38+T细胞，CD38+CD4+T细胞发挥出较高的细胞溶解及产生干扰素-γ的潜能，具有一定的免疫器官损伤的作用[11]。在HCC中，CD38与巨噬细胞特异性标志物CD68共同表达，CD38+CD68+巨噬细胞的密度与HCC患者术后的良好预后相关[10]。

PD-L1表达的增加通常与PD-1抑制治疗的临床疗效较好相关，但并非适用于所有肿瘤[12-14]。其中一个可能的机制是细胞外的腺苷通过肿瘤固有免疫的作用而发挥免疫抑制效应。CD38在一部分治疗所诱导的免疫细胞亚群中具有较高的表达[15]，被认为是一类具有潜力的分子。有研究认为，PD-1/PD-L1抑制剂会因高表达的CD38而出现耐药，在肿瘤免疫微环境中全反式维甲酸和IFN-β释放之后出现，是通过腺苷途径抑制CD8+T细胞的效应，而本研究中发现高表达的CD38与HCC患者的预后相关，这表明CD38与PD-1/PD-L1之间的生物学联系仍有待探索。

本研究通过对晚期HCC患者的临床资料及肿瘤组织进行分析，表明高表达的CD38预示着HCC患者的良好预后。但本研究样本数量少，随访时间短，有待后续研究的进一步开展。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。