雏菊叶龙胆酮通过调节Nrf2/HO-1和caspase-3通路减轻阿霉素诱导的H9c2心肌细胞损伤*

吴江立， 贾玉涛， 田雨卿， 崔清卓， 周勇杰， 武若愚， 李爱英

（1河北中医学院科研中心，河北 石家庄 050035；2石家庄学院化工学院，河北 石家庄 050035；3河北省心脑血管病中医药防治重点实验室，河北 石家庄 050200）

阿霉素（adriamycin；又称多柔比星， doxorubicin， DOX）是一种蒽环类抗肿瘤药物，常用来治疗各种实体肿瘤。但是其剂量依赖的心脏毒性限制了其临床应用，其导致心肌损伤的机制仍未完全明了，氧化应激被认为是影响DOX心脏毒性严重程度的关键途径［1］。核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）信号通路是机体内一条重要的抗氧化通路。雏菊叶龙胆酮（bellidifolin， Bel）是从龙胆科植物中提取出的一类口山酮类化合物，其具有抗氧化和保护心血管系统等作用［2］，但是其对DOX诱导的心肌细胞是否有保护作用尚不得知。有研究报道，雏菊叶龙胆酮可能通过激活血红素加氧酶1（hemeoxygenase-1， HO-1）和谷氨酰半胱氨酸连接酶亚基（glutamate cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）的表达对H2O2诱导的H9c2细胞起到保护作用［3］。本研究拟利用DOX诱导大鼠H9c2心肌细胞模拟DOX心脏损伤模型，通过体外实验观察雏菊叶龙胆酮对DOX诱导的H9c2心肌细胞的作用，并探讨其可能的机制。

材料和方法

1 细胞

大鼠心肌细胞系H9c2由河北中医学院中西医结合肝肾病证研究重点实验室惠赠。

2 主要试剂

DOX为Biotech产品；抗Nrf2抗体、抗caspase-3抗体、抗Bcl-2抗体，抗GAPDH抗体购自Proteintech；Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1， Keap1）抗体购自Abcam；抗tubulin抗体、抗谷氨酰半胱氨酸连接酶修饰亚基（glutamate cysteine ligase modifier subunit， GCLM）抗体、抗HO-1抗体、抗NAD（P）H醌氧化还原酶1［NAD（P）H-quinone exidoreductase 1， NQO1］抗体、抗 Bax抗体及TUNEL检测试剂盒购自武汉塞维尔生物技术有限公司；DMEM高糖培养基购自Gibco；胰酶购自Thermo；胎牛血清购自BI。

3 主要仪器

FUSION FX多功能成像（VILBER LOURMAT）及多功能微孔板读数仪（Thermo Scientific）。

4 主要方法

4.1 H9c2心肌细胞的培养 H9c2大鼠心肌细胞培养在含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养液中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱，每2～3 d传代1次，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

4.2 DOX造模浓度的筛选 取对数生长期的H9c2细胞，以每孔5×103个接种于96孔板，待细胞完全贴壁后，分别设置采用0、0.5、1、2、5、10、20和40 μmol/L的DOX作用细胞24 h，选择最接近IC50值的DOX用药浓度，作为后续实验中DOX的给药浓度。同时设置空白组（只加入培养液，不加细胞）。上述每组细胞设置6个复孔，CCK-8法检测细胞活力。

4.3 CCK-8法检测细胞活力 培养在96孔板中的H9c2细胞达到处理时间后，每孔加入用空培养液配置的10% CCK-8试剂100 μL，放置于37 ℃培养箱中孵育1 h，在450 nm波长下检测其吸光度（absorbance，A）。细胞活力（%）=（A实验-A空白）/（A对照-A空白）×100%

4.4 雏菊叶龙胆酮浓度的筛选 取对数生长期的H9c2细胞，以每孔5×103个接种于96孔板，待细胞完全贴壁后，分别以0、3.125、6.25、12.5、25、50和100 μmol/L的雏菊叶龙胆酮处理H9c2细胞24 h，CCK-8法检测细胞活力，筛选出对细胞无毒性的给药浓度。

4.5 雏菊叶龙胆酮对DOX诱导的H9c2细胞的作用 将H9c2细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后，分别用12.5、25、50 μmol/L雏菊叶龙胆酮预处理H9c2细胞10 h后，再加入5 μmol/L的DOX共同作用 24、48、72 h，同时设置模型组（只加入培养液和5 μmol/L的DOX），CCK-8法检测细胞活力，选取最佳给药浓度和时间。后续实验分别设置正常对照（control）组、DOX组，DOX和雏菊叶龙胆酮联合给药（DOX+Bel）组。

4.6 TUNEL染色检测细胞凋亡 将H9c2细胞以每孔3×105个接种于6孔板，根据实验要求设置不同的分组，采用4%多聚甲醛固定细胞，随后加入Triton X-100破膜，PBS清洗后按照TUNEL试剂盒说明书进行细胞凋亡染色，最后用含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并拍照。

4.7 Western blot检测细胞内相关蛋白的表达水平 各组细胞用PBS洗涤2次后，按照试剂盒说明书提取总蛋白。采用BCA法检测蛋白浓度，将蛋白经10% SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜，室温封闭1.5 h，TBST清洗后加入Ⅰ抗（抗 Keap1、Nrf2、HO-1、GCLM、NQO1、Bcl-2、Bax和caspase-3抗体），4 ℃孵育过夜，洗涤之后加入相应的Ⅱ抗室温孵育1 h，TBST清洗后采用ECL试剂在多功能成像系统下采集图像。

5 统计学处理

实验结果采用SPSS 22.0进行统计学分析，数据以平均值±标准差（mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析以及LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 DOX造模浓度的确定

与正常对照组相比，0.5、1、2、5、10、20、40 μmol/L的DOX分别作用H9c2细胞24 h，均可使细胞活力显著降低（P＜0.05）。DOX的给药浓度不断加大，细胞活力持续降低，见图1。后续实验选取DOX使细胞活力接近IC50时的作用浓度，即5 μmol/LDOX作用24 h建立DOX诱导的H9c2细胞损伤模型。

Figure 1. Effects of different concentrations of DOX on the viability of H9c2 cells. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs 0 μmol/L DOX group.图1 不同浓度的DOX对H9c2细胞活力的影响

2 雏菊叶龙胆酮浓度的确定

与正常对照组比较，3.125、6.25、12.5、25和50 μmol/L的雏菊叶龙胆酮作用24 h对细胞活力均无显著影响（P＞0.05），100 μmol/L的雏菊叶龙胆酮可以显著降低H9c2细胞活力（P＜0.05），因此后续实验选择浓度0～50 μmol/L作为雏菊叶龙胆酮的给药区间，见图2。

Figure 2. Effects of different concentrations of bellidifolin（Bel）on the viability of H9c2 cells. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs 0 μmol/L Bel group.图2 不同浓度的雏菊叶龙胆酮对H9c2细胞活力的影响

3 雏菊叶龙胆酮对DOX诱导的H9c2心肌细胞损伤的作用

与正常对照组相比，DOX处理24 h、48 h、72 h后，细胞活力均显著降低（P＜0.05），经12.5、25、50 μmol/L的雏菊叶龙胆酮预处理后细胞活力提升，且DOX作用24 h时，雏菊叶龙胆酮提升细胞活力效果最显著（P＜0.05）。三个剂量组中50 μmol/L的雏菊叶龙胆酮效果最好（图3），故采用50 μmol/L雏菊叶龙胆酮预处理10 h，DOX造模24 h进行后续实验。

4 雏菊叶龙胆酮对Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达的影响

Western blot 结果显示，DOX刺激后，H9c2心肌细胞的Keap1、Nrf2、HO-1、GCLM和NQO1表达显著降低（P＜0.05），而经雏菊叶龙胆酮预处理后，Keap1、Nrf2、HO-1、GCLM和NQO1的蛋白表达显著升高（P＜0.05），见图4。

5 雏菊叶龙胆酮对DOX诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果显示，DOX诱导的模型组心肌细胞凋亡较正常对照组显著增多（P＜0.05），雏菊叶龙胆酮预处理可以减少细胞凋亡（P＜0.05），见图5。

Figure 3. Effects of bellidifolin （Bel） on the viability of H9c2 cells induced by DOX. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs DOX group.图3 雏菊叶龙胆酮对DOX诱导的H9c2心肌细胞活力的影响

Figure 4. Effects of bellidifolin （Bel） on the expression levels of Nrf2/HO-1 signaling pathway-related proteins in H9c2 cells induced by DOX. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs DOX group.图4 雏菊叶龙胆酮对DOX诱导的H9c2心肌细胞中Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示DOX刺激后，H9c2心肌细胞Bcl-2/Bax比值降低，cleaved caspase-3蛋白表达升高，而雏菊叶龙胆酮预处理可以提高DOX诱导的H9c2细胞中Bcl-2/Bax比值，降低cleaved caspase-3表达，见图6。

讨 论

随着全球肿瘤患者生存率的提高，心血管疾病目前是肿瘤幸存者长期发病率和死亡率升高的第二大原因。DOX是蒽环类抗生物的代表性药物，临床上常用来治疗各种肿瘤，但会引起严重的心脏毒性，临床表现为不可逆的心肌病，最终导致心力衰竭，从而限制了其应用［4］。目前，右丙亚胺为FDA批准的唯一用于DOX心脏毒性的药物，然而其会降低肿瘤细胞对化疗的敏感性，并加剧骨髓抑制［5］，因此，迫切需要开发安全有效的药物来减轻DOX等蒽环类药物引起的心脏毒性。

雏菊叶龙胆酮作为天然的口山酮类化合物，在龙胆科药用植物中分布广泛，研究报道其具有抗氧化、改善心律失常、抑制凋亡［6-7］等功效。本课题利用DOX诱导大鼠H9c2心肌细胞模拟心脏损伤，探究雏菊叶龙胆酮对心脏的保护作用。DOX刺激后，H9c2细胞活力降低，雏菊叶龙胆酮预处理可以提高细胞活力，说明其对DOX诱导的H9c2心肌细胞损伤有一定抑制作用。另外，有文献报道雏菊叶龙胆酮对人A549肺癌细胞的增殖具有抑制作用，而不会抑制正常肺上皮细胞的增殖［8］。雏菊叶龙胆酮可减轻DOX诱导的H9c2细胞损伤，同时还具有抑制肺癌肿瘤细胞增殖的作用，有可能应用于蒽环类化疗药物的心脏保护，其心肌保护的具体机制值得深入探究。

研究显示，细胞凋亡参与DOX诱导的心脏损伤，减少心肌细胞凋亡可以减轻DOX诱导的心脏损伤［9-10］。本研究利用TUNEL染色和Western blot检测H9c2细胞凋亡程度，结果显示DOX诱导的H9c2心肌细胞中Bcl-2/Bax的比值减少，cleaved caspase-3表达升高，细胞凋亡比例增多，与文献报道一致［9］。雏菊叶龙胆酮预处理可上调H9c2心肌细胞中Bcl-2/Bax的比值，降低cleaved caspase-3的表达，降低细胞凋亡比例，本结果提示雏菊叶龙胆酮可通过抑制凋亡蛋白的表达，减轻DOX诱导的H9c2大鼠心肌细胞损伤。

Figure 5. TUNEL staining was used to detect the effects of bellidifolin on apoptosis of H9c2 cells induced by DOX. Scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs DOX group.图5 TUNEL染色检测雏菊叶龙胆酮对DOX诱导的H9c2细胞凋亡的影响

氧化应激是DOX诱导心脏毒性发生发展的主要机制之一［11-12］。DOX诱导的心脏损伤中，活性氧（reactive oxygen species， ROS）的积累伴随着心脏抗氧化防御系统的紊乱，抗氧化剂有助于改善与DOX相关的心肌病［13-14］。Nrf2是一种细胞保护转录因子，在调控细胞内的氧化还原动态平衡中起着关键作用。正常生理状态下，Nrf2与Keap1结合存在于细胞质中，机体处于氧化应激状态时，Nrf2从Keap1分离并易位到细胞核中，调控下游抗氧化酶的表达［15］。研究报道Nrf2激动剂可预防DOX诱导的大鼠慢性心力衰竭［16］，敲除Nrf2基因的小鼠，DOX诱导的ROS生成增多，心脏损伤更为严重［17］，激活Nrf2可通过调节凋亡蛋白（Bcl-2，Bax）抵抗凋亡［18］，减轻DOX诱导的心脏毒性［19-20］。雏菊叶龙胆酮由于其带有的3个酚羟基，使其具有强的抗氧化活性。文献报道雏菊叶龙胆酮通过激活Nrf2通路下游的抗氧化蛋白酶HO-1从而对H2O2诱导的H9c2细胞起到抗氧化保护作用［3］。本研究结果显示DOX刺激后，Keap1、Nrf2蛋白表达下降，Nrf2的信号通路被抑制，与Zhao等［20］在DOX心脏病实验中的结果一致，表明DOX诱导的活性氧化剂的产生大于抗氧化剂的作用，导致DOX处理后H9c2心肌细胞的氧化应激损伤，雏菊叶龙胆酮预处理后增加了Keap1、Nrf2以及下游的HO-1、NQO1和GCLM蛋白的表达。提示雏菊叶龙胆酮可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路，提高细胞抗氧化能力，抑制细胞凋亡、减轻DOX处理的H9c2心肌细胞损伤。

Figure 6. Effects of bellidifolin on the expression levels of Bcl-2， Bax （A） and cleaved-caspase 3 （B） in H9c2 cells induced by DOX.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs DOX group.图6 雏菊叶龙胆酮对DOX诱导的H9c2细胞中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3蛋白表达的影响

综上所述，本研究结果提示，雏菊叶龙胆酮可能通过激活Nrf2/HO-1通路、增加Nrf2、HO-1等保护因子的水平，减轻氧化应激、抑制细胞凋亡，对DOX诱导的H9c2大鼠心肌细胞起到保护作用。本研究通过细胞体外实验，为雏菊叶龙胆酮抑制蒽环类药物心脏毒性作用提供了参考。