小檗碱逆转肿瘤多药耐药的研究进展

聂旭阳，高笑男，高敬林，花 丽，孙亚棋，冯章英，王明霞

(河北医科大学第四医院临床药理研究部，河北 石家庄 050000)

据统计，90%以上的肿瘤转移患者化疗失败及肿瘤初始治疗缓解后3年内的临床复发均与肿瘤多药耐药性(multidrug resistance,MDR)有关[1]。其中，MDR意指长期使用一种化疗药后，肿瘤细胞不仅对其产生耐药性，同时也对与其作用机制和结构不同的多种化疗药物产生耐药性。目前克服MDR的主要策略为药物联合疗法，例如化疗药物与 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKI)或促凋亡剂等单一机制的药物联合使用[1]。但由于肿瘤细胞发生耐药的机制是复杂多样的，且联合疗法不可避免的会增大毒副作用。因此，迫切需要寻找低毒、多途径逆转肿瘤耐药、提高化疗效果的手段。

中药作为临床化疗常见的辅助用药，具有作用机制靶点多、毒副作用小的特点。随着对中药抗肿瘤作用的研究，中药单体及其提取物成为研究肿瘤MDR逆转剂的热点之一[2]。小檗碱(C20H19NO5)亦称黄连素，是从中药黄连中分离的一种苯并异喹啉季铵型生物碱，低毒、价廉，是黄连抗菌的主要有效成分。目前临床有盐酸盐及鞣酸盐形式的单药，用于治疗细菌性胃肠炎、痢疾等消化道疾病[3]。近年来，研究发现，小檗碱可在多类肿瘤中通过促进细胞凋亡、抑制药物外排和肿瘤微环境调节因子改变等多种机制发挥逆转肿瘤MDR的作用[4-6]。故而，本文对近年来国内外有关小檗碱在肿瘤中抗耐药的作用进行了总结，为小檗碱今后成功应用于临床逆转肿瘤耐药提供参考。

1 小檗碱逆转消化系统肿瘤的多药耐药

铂类、氟尿嘧啶类等化疗药物及厄洛替尼、西妥昔单抗等靶向药物是治疗消化系统肿瘤常用药物。但在治疗初期或用药一段时间后，由于细胞凋亡减少、药物外排蛋白和肿瘤微环境的改变、耐药相关酶和DNA损伤修复的增加等，消化系统肿瘤细胞常出现MDR[4-6]。目前，已有多项研究显示，小檗碱在逆转上述消化系统肿瘤MDR方面有显著的效果。以下结合国内外相关文献对其进行总结。

1.1 小檗碱影响细胞凋亡蛋白表达逆转耐药细胞凋亡受阻是导致肿瘤 MDR 的重要原因。而小檗碱可通过多种机制影响细胞内抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表达，促进肿瘤细胞凋亡，逆转消化系统肿瘤细胞MDR。陈琳等[4]在小檗碱对奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)耐药的人结肠癌THC-8307/OXA细胞株耐药性影响的研究中发现，5～20 μmol·L-1低浓度的小檗碱对THC-8307细胞和THC-8307/OXA细胞存活率的影响无明显差异。但与THC-8307细胞相比，小檗碱与OXA合用时可显著降低THC-8307/OXA细胞存活率(P<0.05)，可呈剂量依赖递增性逆转细胞的耐药性达5～20倍。提示小檗碱是潜在的结肠癌OXA耐药逆转剂。

半胱氨酸蛋白酶(Caspase)与细胞凋亡密切相关。其被活化后可发生凋亡蛋白酶的级联反应，致使细胞不可逆性凋亡。在以人胃癌顺铂(cisplatin,DDP)耐药细胞株BGC-823/DDP、SGC-7901/DDP及其亲本细胞为研究对象的研究中发现，与其亲本细胞相比，SGC-7901/DDP和BGC-823/DDP明显对DDP耐药。但经小檗碱处理后，耐药情况均可被部分逆转。蛋白水平显示，小剂量、不影响耐药细胞增殖(抑制率低于5%)的小檗碱能部分恢复凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9在耐药细胞中的表达和活性，从而促进耐DDP肿瘤细胞凋亡[5-7]。因此，促进Caspase依赖性凋亡可能是小檗碱发挥逆转胃癌细胞DDP耐药的机制。

信号传导与转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是凋亡抑制蛋白存活素(Survivin)表达所必需的转录因子。Survivin-STAT3介导的致癌信号通路具有抗凋亡和促进增殖的作用，是肿瘤原发耐药的机制之一。与单用小檗碱或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)相比，两药联合应用24 h时可显著降低胃腺癌AGS细胞的存活率、下调Survivin(约95%)和pSTAT3表达(高达90%)。进一步研究发现，该信号通路也是通过显著升高活性蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达，而与诱导胃癌细胞凋亡，克服化疗耐药相关联的[8]。

分子靶向药物比传统化疗药物具有更好的疗效，但也不可避免肿瘤耐药的发生[9]。Wang等[10]研究发现，在逆转表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)厄洛替尼、西妥昔单抗等耐药方面，小檗碱也具有较大的潜力。与小檗碱组、厄洛替尼单用组相比，联用组可降低由STAT3通路调节的抗凋亡蛋白Bcl-xL和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)等的表达，显著升高聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)裂解水平，剂量依赖性抑制胃癌SGC7901、BGC823、MKN45细胞的增殖，使细胞凋亡率由单用17.7%和9.4%增加至56.2%(P<0.01)；胃癌移植瘤裸鼠模型显示，小檗碱与西妥昔单抗联用组的肿瘤体积和质量明显低于单药组，生存时间明显高于对照组(90 dvs50～70 d,P<0.05)。其联合EGFR-TKI可通过EGFR/STAT3通路增加药物疗效，减少酪氨酸激酶受体旁路激活导致的EGFR抑制剂耐药的现象。

miR-203可与mRNAs结合阻止蛋白质翻译或直接降解mRNA，已被证明具有抑制胃癌的作用。You等[5]采用DDP、小檗碱单药和小檗碱联合DDP分别处理BGC-823/DDP和SGC-7901/DDP细胞株。结果，与单药组比，小檗碱联合DDP可显著降低DDP在耐药细胞中的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值，小檗碱有逆转胃癌DDP耐药的作用。机制研究发现，加用小檗碱可使耐DDP肿瘤细胞内过表达miR-203，进而抑制其下游抗凋亡蛋白Bcl-w的表达，促进凋亡，增强耐药胃癌细胞对DDP的敏感性。故其逆转作用可能是通过改变miR-203/Bcl-w相关的凋亡通路实现的。

此外，研究发现，伊立替康(irinotecan,CPT-11)可导致多种人结直肠癌细胞株中核转录因子NF-κB的激活，增加抗凋亡基因的表达，阻碍肿瘤细胞凋亡，导致结直肠癌细胞对CPT-11普遍具有耐药性。而2.5～10 μmol·L-1小檗碱可以剂量依赖性提高CPT-11对细胞的抑制率，降低c-IAP1、c-IAP2、Survivin和Bcl-xl等由NF-κB调控的抗凋亡蛋白的表达，从而增强CPT-11诱导的细胞凋亡，减少化疗抵抗[11]。当热休克蛋白90抑制剂NVP-AUY922联合小檗碱处理不敏感的大肠癌细胞时，可通过抑制CDK4的表达和miR-296-5p介导的Pin1-β-catenin-cyclin D1信号通路而导致细胞生长停滞，抑制NVP-AUY922诱导的结直肠癌细胞耐药性[12]。即小檗碱还可通过降低NF-κB有关的抗凋亡蛋白等促进凋亡，发挥逆转消化系统肿瘤MDR的作用。

1.2 小檗碱抑制药物外排蛋白表达逆转耐药P-gp、MDR相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)等药物转运蛋白可与药物结合将已进入细胞内的药物从胞内泵出胞外，致使细胞内达不到有效药物浓度，从而使肿瘤细胞产生耐药[13]。孙梦瑶等[6]发现，与空白组比，应用1 mg·L-1DDP后SGC-7901/DDP细胞株内耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达显著升高；而加入小剂量的小檗碱(8 μmol·L-1)与DDP共同作用24 h或48 h后，耐药细胞内P-gp、MRP的表达均明显被抑制(P<0.01)。Kou等[7]在BGC-823/DDP细胞株也观察到此类现象，并在利用SGC-7901/DDP细胞建立的小鼠皮下肿瘤模型中得到了与体外实验一致的结果。与空白对照组比较，DDP或小檗碱单用对肿瘤生长仅有轻微抑制作用，而联合组可抑制耐药细胞体内肿瘤的生长约50%。提示小檗碱逆转胃癌细胞MDR的机制也可能与降低P-gp、MRP等耐药相关转运蛋白的表达、增加DDP在胃癌细胞内累积有关。

1.3 小檗碱影响PI3K及其下游信号通路逆转耐药胃癌耐药性相关研究发现，耐DDP胃癌细胞内的蛋白激酶B (protein kinase B,Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的磷酸化水平明显高于其亲本细胞株。PI3K/Akt/mTOR信号通路系调节多种肿瘤耐药性的途径之一。而小檗碱可抑制该通路发挥逆转耐药的作用[7]。与对照组相比，DDP或小檗碱单独处理后，BGC-823/DDP和SGC-7901/DDP细胞内Akt和mTOR的磷酸化仅略有下降。但当两药联合处理可显著抑制上述DDP耐药细胞中磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3 kinases，PI3K)、Akt和mTOR的磷酸化，进而抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡和自噬等[7]。即抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路也可能是小檗碱提高胃癌对DDP化疗敏感性的机制之一。

1.4 小檗碱抑制肿瘤微环境调节因子功能逆转耐药过表达的葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)可被分泌到胞外，产生强大的调节肿瘤微环境的作用，如抵抗凋亡、逃逸免疫等，是肿瘤耐药性产生的重要原因。而小檗碱可与ATP竞争性结合GRP78，使GRP78成为无活性的二聚体或多聚体，抑制其进入外泌体，最终使GRP78失去调节肿瘤微环境的作用。当10 μmol·L-1小檗碱联合5-FU使用时，可显著抑制人结肠癌细胞系DLD1、HCT-116的生长增殖，提高5-FU的化疗效果[14]。

综上所述，小檗碱是具有发展前景的消化系统肿瘤MDR逆转剂。小檗碱以促进肿瘤耐药细胞凋亡为主的方式逆转消化系统肿瘤MDR，机制包括抑制抗凋亡蛋白NF-κB的激活、促进Caspase依赖性凋亡；影响miR-203/Bcl-w、Survivin-STAT3、EGFR/STAT3等信号通路等。此外，抑制药物转运蛋白MRP和P-gp、影响耐药相关PI3K/Akt/mTOR 信号通路、阻碍GRP78调节肿瘤微环境等也可能是小檗碱发挥逆转MDR的作用机制。

2 小檗碱逆转乳腺癌多药耐药

乳腺癌已成为女性发病率、死亡率最高的肿瘤。化疗过程中癌细胞周期调控、自噬和能量代谢异常等，可使得乳腺癌对化疗药出现抵抗[15-17]。作为有潜力的消化系统肿瘤MDR逆转剂，小檗碱在逆转乳腺癌耐药方面也得到了广泛的关注。

2.1 小檗碱抑制药物外排蛋白表达逆转多药耐药Qian等[15]利用特异的荧光素酶报告分析生物发光成像技术分析发现，BBR/DOX配比为2 ∶1时，在体外对乳腺癌细胞株MCF-7/DOXFluc 有最佳的协同抑制增殖作用。小檗碱在耐药细胞株异种移植模型体内可显著下调P-gp/ABCB1和MRP1/ABCC1的表达，减少DOX的外排，增加肿瘤组织对DOX的摄取，提高了DOX在肿瘤细胞内的浓度和滞留率。

2.2 小檗碱作为肿瘤细胞自噬抑制因子逆转耐药自噬能维持正常细胞内环境和蛋白平衡等重要生命过程，但高水平的自噬也会使乳腺癌细胞对DOX耐药，逃避凋亡[16]。小檗碱作为一种自噬抑制因子，有望改善自噬介导的肿瘤药物抵抗。Wang等[16]建立了耐药乳腺癌MCF-7/DOX细胞系及其裸鼠移植瘤模型，研究发现小檗碱联合DOX能以剂量依赖的方式显著抑制肿瘤细胞生长。其中，经100 μmol·L-1小檗碱处理后，耐药细胞对DOX的敏感性增加，细胞内自噬相关蛋白LC3II积累降低，p62累积增加，自噬小体的形成受到抑制。机制研究发现，小檗碱可通过抑制磷酸酶和张力蛋白同源缺失基因(phosphatase and tensin homolog,PTEN)的表达以及调节PTEN/Akt/mTOR信号通路发挥逆转乳腺癌DOX耐药的作用。

2.3 小檗碱影响活性氧水平逆转耐药HER2/EGFR 双重TKI -拉帕替尼，是一种治疗人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阳性乳腺癌的新型靶向药物制剂，对曲妥珠单抗耐药的乳腺癌细胞株也有效[17]。但当单独使用拉帕替尼6个月以上时，大多数患者会产生获得性耐药，致使治疗失败。研究显示，拉帕替尼耐药的发生与肿瘤细胞自噬水平较高、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平较低有关。拉帕替尼通过激活BT-474LapR细胞株内C-Myc/pro-Nrf2 通路和GSK-3β信号来稳定核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)并维持低水平的ROS，致使该细胞株对拉帕替尼耐药。而相较单药组，小檗碱和拉帕替尼联合应用于上述耐药细胞系时，可显著抑制耐药细胞内C-Myc基因及其转录产物Nrf2，增加ROS的产生[18]。即小檗碱可通过逆转乳腺癌耐拉帕替尼细胞株内ROS水平低的方式发挥作用。

2.4 小檗碱逆转缺氧诱导所致的耐药缺氧、AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)通路上调均会导致肿瘤能量的异常，产生耐药性[19]。小于20 μmol·L-1小檗碱对乳腺癌细胞株 MCF-7/MDR 凋亡率影响与空白组无显著差异，但联合DOX时可通过激活AMPK，进而下调缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和P-gp的表达，降低MCF-7/MDR细胞株的药物抵抗[19-20]，并在该耐药瘤移植小鼠模型进行了验证。故调节AMPK-HIF信号通路可能是小檗碱逆转乳腺癌MDR的机制之一。

由上可见，小檗碱在乳腺癌MDR方面也有较好的前景。通过调节自噬、影响ROS水平、改善缺氧等是小檗碱在逆转乳腺癌MDR方面目前发现的特有机制，在其他瘤种中是否也能利用上述机制发挥逆转MDR作用有待进一步探索。

3 小檗碱逆转白血病的多药耐药

癌细胞异常的增殖、分化和凋亡与白血病的发病密切有关。而小檗碱大剂量单用有抑制增殖、促进白血病细胞凋亡的作用；小剂量低浓度联合化疗药时也能发挥改善肿瘤药物抵抗的作用[21]。

3.1 小檗碱抑制药物外排蛋白功能逆转耐药王天晓等[21]发现，无毒剂量的小檗碱可抑制白血病K562/DOX耐药细胞的P-gp外排功能，增加耐药细胞内DOX蓄积量和细胞凋亡率，使DOX对耐药细胞的半数抑制浓度下降1.5倍，发挥逆转K562细胞对DOX耐药的作用。

3.2 小檗碱逆转BCR-ABL 蛋白突变诱导耐药分子靶向治疗药物伊马替尼是第一代BCR-ABL抑制剂，是慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)患者的一线用药。然而，40%～60%的患者在急性期会出现BCR-ABL 蛋白ABL激酶区域突变，影响伊马替尼的结合，产生药物抵抗，导致治疗失败[22]。小檗碱可抑制BCR-ABL以及T315I突变BCR-ABL蛋白的活性，募集和自噬降解E3泛素蛋白连接酶- LRSAM1。与两药单用相比，小檗碱和伊马替尼合用时，BaF3-P210-T315I耐药细胞株的活力明显下降，耐药CML小鼠模型的活性、集落形成受到抑制，存活时间延长[22-23]。提示小檗碱可通过泛素化途径降解 BCR-ABL融合蛋白，克服慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼的耐药性。

可见，抑制药物外排蛋白表达和功能是小檗碱逆转多类肿瘤MDR的通用机制。针对白血病特定的 BCR-ABL 蛋白突变导致的靶向药物耐药同样具有逆转作用。

4 小檗碱逆转肺癌的多药耐药

有关小檗碱逆转肺癌 MDR 方面的研究相对缺乏，已发现的机制如下。

4.1 小檗碱影响细胞凋亡蛋白表达逆转顺铂耐药铂类也是肺癌推荐的一线化疗药物，其在不同肿瘤中有部分相同的耐药机制。小檗碱促进耐药肿瘤细胞凋亡的机制也能在DDP耐药肺癌发挥作用。与单用320 μmol·L-1DDP相比，联合20 μmol·L-1小檗碱用药可使耐药肺腺癌细胞A549/DDP存活率由55.27%降低为37.47%。小檗碱可抑制NF-κB的活性和耐药细胞中p65的表达，增加IκBα蛋白的表达，逆转肺腺癌DDP耐药[24]。此外，曾玲芳等[25]发现，与空白对照组或单药组比较，联用组的促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax表达明显上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下调，小檗碱可时间-浓度依赖性抑制肺癌耐药A549/DDP细胞增殖，促进细胞凋亡。

4.2 小檗碱干预增殖及EMT过程逆转EGFR-TKI 耐药 吉非替尼同样属于 EGFR-TKI ，其仅在治疗初期对EGFR敏感突变的非小细胞肺癌患者疗效好，用药一段时间后或EGFR不敏感突变的患者通常会出现耐药，治疗效果欠佳[26]。Zheng等[26]发现，小檗碱与吉非替尼联合后可通过PDPK1/Sp1/DNMT1信号通路显著抑制 EGFR-TKI 不敏感的肺癌A549细胞和对 EGFR-TKI耐药的肺癌H1975细胞的增殖，并通过LncRNA HOTAIR/miR-34a-5p/Snail信号通路协同抑制上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程。体表荷瘤小鼠模型和尾静脉注射肺癌转移模型的肿瘤生长及相关基因的表达情况与体外实验结果一致，联合用药组比单药组的肿瘤质量更轻，体积更小(P<0.05)。以上结果说明,小檗碱可改变耐吉非替尼非小细胞肺癌细胞的增殖，甚至逆转其EMT过程。

Tab 1 Effect of berberine on reversing drug resistance of tumor to molecular targeted drugs

小檗碱对分子靶向药物的耐药作用总结见Tab 1。

5 其他

除上述瘤种外，小檗碱也能克服其他的类型的肿瘤MDR。利用顺铂耐药的卵巢癌A2780/DDP、SKOV3细胞株进行的研究中发现，小檗碱逆转卵巢癌耐药的机制与miRNA有关，其可能通过调节miR-93/PTEN/Akt信号通路或miR-21/PDCD4轴增加卵巢癌顺铂化疗的敏感性[27]。Qu等[28]发现，小檗碱通过ERK1/2信号通路诱导替莫唑胺不敏感的胶质母细胞瘤U87/TMZ-R和U251/TMZ-R株的自噬，从而降低替莫唑胺的耐药性。小檗碱也可通过影响粘着斑激酶、尿激酶(Urokinase,uPA)和NF-κB信号通路抑制耐威罗菲尼(PLX4032)黑色素瘤A375-S2细胞的体外迁移率[29]。

6 总结与展望

MDR是目前肿瘤治疗的关注热点，小檗碱作为天然产物具有对多种类型的肿瘤治疗的逆转耐药的作用，有望未来被开发为胃癌、乳腺癌等多种肿瘤治疗的耐药逆转剂。但小檗碱水溶性和口服吸收差、静注后在体内分布广泛且消除较快，使得靶组织药物不能达到有效浓度或有效浓度维持时间短。虽然已有盐酸小檗碱的控释片、小檗碱和CPT-11的共递送脂质体lipBI、小檗碱与10-HCPT形成的脂质纳米粒及Janus型纳米复合物(Fe3O4-MSN/Dox+Ber@HA-QD)等优良剂型被设计成型，但目前仍都处于研究阶段[30]。另外，小檗碱体外有效逆转肿瘤细胞MDR的结果是否可转化至人体内，小檗碱与化疗药的药动学行为和药物效应是否与体外实验一致尚有待继续研究。总之，今后小檗碱的研究侧重点应在筛选优良剂型、开展小檗碱抗肿瘤和逆转肿瘤MDR的有效性和安全性的临床试验等方面做进一步研究。