基于谷胱甘肽刻蚀核壳Au@MnO2纳米粒子比色检测谷胱甘肽

肖传豪

(濮阳职业技术学院，河南大学 濮阳工学院，河南 濮阳 457000)

谷胱甘肽（GSH）是细胞内含量最丰富的生物硫醇，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成[1-2].GSH在生物系统中起着至关重要的作用，参与细胞内信号转导、维持细胞内氧化还原活性、基因调控和外源代谢等多种细胞功能[3-4]，其在人体内浓度异常与多种疾病有关，如癌症、艾滋病病毒（HIV）、神经退行性疾病、肝病和衰老等[5-6].

目前检测GSH的方法主要有质谱[7]、荧光[8]、电化学[9]和表面增强拉曼散射[10].然而，大多数方法需要使用复杂的仪器、繁琐的预处理或高检测成本，这些都大大阻碍了它们的实用性.为了满足临床和医学的需要，开发简单、快速、灵敏的GSH检测方法十分必要.比色法是一种简单、快速、灵敏且可视化的检测方法，近年来备受关注[11].

本实验体系的设计原理是基于GSH能还原刻蚀MnO2的特性.如图1所示，当GSH存在时，由于MnO2具有很强的氧化能力，因此Au@MnO2的外壳MnO2很容易被GSH还原刻蚀成Mn2+.随着GSH浓度的增加，MnO2壳层被刻蚀的程度增强，导致溶液在400 nm处的溶液吸光度降低，溶液由浅绿色变成浅红色.该方法简单快速、特异性强、灵敏度高、可实现可视化检测，并可应用实际血清样品中GSH的检测.

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂UV-vis 2550型紫外可见分光光度计（日本岛津）；H-7560型透射电子显微镜（日本日立公司）；实验级超纯水器（美国艾科浦公司）.高锰酸钾、聚-（烯丙胺盐酸盐）、四水氯金酸（HAuCl4·4H2O）、柠檬酸钠、谷胱甘肽（美国Sigma公司），均为分析纯，未经纯化.

1.2 纳米Au@MnO2纳米粒子的制备两步法合成Au@MnO2纳米粒子.第一步，合成纳米金种子，将0.74 mL 100 mmol/L氯金酸注入到295 mL超纯水中并在剧烈搅拌下加热到100 ℃，然后快速将4.5 mL 0.5%柠檬酸钠溶液加入上述溶液中，反应15 min后，溶液颜色变为红色，得到平均粒径为50 nm的金种子溶液.第二步，合成Au@MnO2纳米粒子，将1.5 mL KMnO4溶液（22 mg/mL）添加到上述制备的纳米金（AuNPs）中，剧烈搅拌下反应5 min后，将3 mL 25 mg/mL聚-（烯丙胺盐酸盐）（PAH）溶液缓慢加入上述溶液反应1 h，颜色变为深绿色，最后，以10 000 r/min的转速离心10 min，并用纯水洗涤3次，将制备的Au@MnO2分散于60 mL水中备用.

图1 基于Au@MnO2纳米粒子还原刻蚀比色检测GSH示意图Fig.1 Schematic illustration for colorimetric detection of GSH based on Au@MnO2 nanoparticle reduction etching

1.3 实验方法将500 μL的Au@MnO2纳米粒子溶液和300 μL磷酸缓冲盐溶液（PBS）（pH=6.2）充分混合，然后分别加入含不同浓度GSH的200 μL PBS溶液，常温下反应2 min，测定400 nm处的吸光度值，以吸光值对GSH浓度绘制标准曲线.

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化考察溶液pH值对溶液吸光度的影响，在酸性条件下，在Au@MnO2溶液中加入GSH后，氧化还原反应按以下方程式进行：

其中GSSG为氧化型谷胱甘肽.

如图2所示，随着溶液pH的增加，溶液在400 nm处的吸光度逐渐降低.当pH值超过6.2时，吸光度开始增加，表明pH=6.2时，MnO2最容易被GSH还原刻蚀.因此，pH=6.2被选择溶液的最佳pH值.另外，MnO2和GSH的反应时间也是影响GSH传感灵敏度的一个重要因素，通过实验发现，MnO2和GSH的反应在2 min内达到稳定，因此，本工作将GSH与MnO2的反应时间设定为2 min.

图2 溶液pH值对Au@MnO2溶液吸光度的影响Fig.2 Effect of solutions pH on the absorbance of Au@MnO2 solution

2.2 Au@MnO2纳 米 粒 子 表 征透 射 电 镜 图 如图3（a）所示，中心的Au核被MnO2的紧密包覆层包围，形成了均匀的核壳结构.纳米金的平均粒径为50 nm，金纳米粒子表面的MnO2壳层厚度为15～30 nm.由吸收光谱（图3（b））可见，400 nm和600 nm分别对应于MnO2和纳米金的红移.图3（c）中的HRTEM图像显示出纳米金的晶格间距是0.21 nm，对应于Au的（111）晶面（JCPDS No.4-784），MnO2的晶格间距是0.24 nm，对应于MnO2的（301）晶面（JCPDS No.44-0141）[12].Au@MnO2纳米粒子和不同浓度GSH反应后的TEM（图4）显示MnO2外壳能被GSH充分刻蚀.

图3 Au@MnO2纳米粒子表征Fig.3 The characterization of Au@MnO2 nanoparticles

图4 不同浓度的GSH刻蚀Au@MnO2后的TEM图Fig.4 TEM images of Au@MnO2 after etching by different concentrations of GSH

2.3 GSH灵敏度分析为了研究这种基于Au@MnO2纳米粒子的比色方法用于定量检测GSH的可行性，测量不同GSH浓度下传感体系的吸光度信号变化.如图5（a）所示，随着GSH浓度的升高（0，2，5，10，50，100，1 000，5 000，10 000，50 000，100 000 nmol/L），溶液在400 nm处的吸光度逐渐降低，溶液的颜色从浅绿色慢慢变为浅红色.图5（b）（c）显示了在GSH浓度2～100 000 nmol/L范围内，溶液在400 nm处的吸光度与GSH浓度对数值的线性拟合关系，其线性回归方程为y=0.446-0.027x（R2=0.95）（其中y代表溶液吸光度，x代表GSH浓度对数值）.根据3σ/slope[13]计算GSH的检测限（LOD）为1.62 nmol/L.其中σ代表仪器的相对标准偏差，slope是线性拟合直线的斜率.与其他已报道的方法相比，本方法的检测性能出示了较低的检测限和更宽的线性响应范围（表1）.

2.4 特异性分析为研究本检测方法对GSH的特异性，实验选用赖氨酸（Lys），组氨酸（His），精氨酸（Arg），天门冬氨酸（Asp），蛋氨酸（Met），三聚氰胺（Mel）作为干扰物，上述干扰物的浓度均为900 μmol/L.如图6（a）(b）所示，相比于空白溶液，除90 μmol/L GSH引起明显的吸光度值和颜色改变，所有浓度为900 μmol/L的干扰物质其吸光度几乎没有变化，颜色也基本一致.另外，如图6(c)所示，在GSH单独存在以及干扰物（Na+，K+，抗坏血酸和葡萄糖）和GSH共存的情况下，研究了GSH检测的抗干扰性.结果表明GSH和干扰物共存的情况下产生的吸光度改变和GSH单独存在下产生的吸光度改变值几乎相同.因此，将Au@MnO2纳米粒子应用于GSH比色检测具有优异的特异性和抗干扰能力.

图5 不同浓度GSH溶液传感体系吸光度变化Fig.5 The absorption spectra of sensing system with GSH various concentration

表1 不同比色方法检测GSH性能的比较Tab.1 Comparison of different colorimetric methods for GSH detection

图6 本文方法对GSH的特异性和抗干扰性Fig.6 The specificity and anti interference of this colorimetric method toward GSH

2.5 血清中GSH的测定用本方法对真实人体血清样品中GSH的含量进行检测，血清样品来自于当地的濮阳市人民医院.首先，血清被蒸馏水稀释到100倍，然后通过加标的方法向血清样品加入一系列不同浓度的GSH （0，2，5，10，100，1 000，5 000，10 000 nmol/L）.如图7所示，随着GSH浓度的增加，溶液在400 nm处的吸光度逐渐降低.在2～10 000 nmol/L范围内，吸光度值与GSH浓度对数值呈良好的线性关系，其线性回归方程为y=0.436-0.017x，相关系数为0.96.加标血清样品中GSH的平均回收率为95.2%～100.5%，相对标准偏差为1.6%～3.9% （表2）.结果表明该比色法在实际血清样品中检测GSH具有可行性.

图7 实际样品检测结果Fig.7 Real sample test results

表2 GSH的回收率实验Tab.2 Recovery experiment of GSH

3 结论

利用化学还原法合成核壳型的Au@MnO2纳米粒子，通过GSH对MnO2壳层的刻蚀来调节Au@MnO2的形貌发生改变，从而导致溶液颜色发生改变，实现了对GSH的比色检测.该方法具有较宽的检测线性范围和较低的检测限，同时具有操作简单、检测时间短、仪器要求低等优点，弥补了其它方法成本高、需借助大型检测仪器等缺点.