江西槟榔芋疫病病原菌鉴定及室内药剂筛选

邹 芬, 何烈干, 李湘民, 黄瑞荣, 马辉刚

(江西省农业科学院植物保护研究所, 南昌 330200)

芋Colocasiaesculenta(L.)Schott为天南星科芋属作物,在世界热带湿润地区大量种植[1],在我国则主产于广西、广东、福建等地[2]。芋富含糖类、蛋白质、维生素等营养物质[3],是一些发展中国家的重要主食作物[4],据联合国粮农组织报道芋现已成为全球消耗量排名第五的块根类蔬菜[5]。为助力产业扶贫,江西九江永修县在2018年首次引进种植了约1 333 m2槟榔芋。2020年6月-7月,笔者到该地调查后发现在槟榔芋叶片上出现大量坏死斑,部分植株叶柄上也有该症状(图1a～c),与已报道的芋疫病症状基本一致[6]。

芋疫病主要由卵菌芋疫霉PhytophthoracolocasiaeRacib引起,是芋生产中最具破坏性的病害,现已成为全世界芋种植的主要制约因素,每年造成的损失达25%～50%[7]。对病原菌进行准确鉴定是病害有效防控的前提。以往对芋疫病的鉴定主要基于病害症状和病原菌形态学观察,随着分子生物学方法的快速发展,周清平等[8]和陆叶等[9]利用ITS通用引物对芋疫病病原菌进行了鉴定。但是卵菌种间相似度较高,ITS并不能完全区分亲缘关系较近的种[10]。研究表明,多基因序列分析能更准确地鉴定病原菌,三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)和β微管蛋白基因(β-tubulin)也常被用于卵菌特异性分离鉴定的靶标[11-12]。

当前可通过种植抗病品种、加强田间管理、轮作、套作等方式对芋疫病进行防治,但化学防治仍是防控该病害最快、最有效的方法。Cox 等[13]对巴布亚新几内亚地区芋疫病药剂防治试验表明,甲霜灵和王铜防效显著;周清平等[8]对芋疫病防治药剂的筛选结果表明,60%锰锌·氟吗啉可湿性粉剂、50%烯酰吗啉可湿性粉剂和72%霜脲·锰锌可湿性粉剂的防效均在60%以上;叶泉清等[2]对广西荔浦芋的药剂防治试验结果表明，50%烯酰吗啉水分散粒剂和58%甲霜·锰锌可湿性粉剂防效较好,平均防效分别为58.8%和52.4%。然而,由于化学农药的长期使用,加上卵菌遗传变异快,病原菌抗药性的发生时有报道[14]。据报道致病疫霉P.infestans、古巴假霜霉Pseudoperonosporacubensis、腐霉Pythiumsp.等病原菌对甲霜灵均产生了抗性[15-17]。因此,亟须筛选出对槟榔芋有良好防治效果的常用杀菌剂,从而有针对性地对芋疫病进行防治。

本研究采用形态学观察、致病性测定、分子生物学鉴定联合多基因序列分析对槟榔芋疫病的病原菌进行分离鉴定,并测定了7种常用杀菌剂对病原菌的抑制效果,以期为该病害的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1供试菌株

辣椒疫霉P.capsici标准交配型A1、A2菌株由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所戚仁德研究员惠赠。

1.1.2供试药剂

96.8%烯酰吗啉(dimethomorph)原药,安徽丰乐农化有限责任公司;97%霜脲氰(cymoxanil)原药,上海升联化工有限公司;20%氟吗啉可湿性粉剂,沈阳科创化学品有限公司;23.4%双炔酰菌胺悬浮剂、500 g/L氟啶胺悬浮剂,先正达生物科技(中国)有限公司;0.3%丁子香酚可溶液剂,河南省焦作华生化工有限公司;45%敌磺钠湿粉,辽宁省丹东市农药总厂。

1.1.3供试培养基

V8培养基:将罐装V8饮料(330 mL)倒入烧杯中,加入3.3 g CaCO3,混匀后用4层纱布过滤,按1∶9加入纯水进行稀释,如配固体培养基再按1.5%加入琼脂粉;马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA):马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g,蒸馏水定容至1 L。

1.2 病原菌的分离与纯化

于2020年6月至7月从江西省九江市永修县采集典型的槟榔芋疫病染病叶片和叶柄带回实验室,采用常规组织分离法分离病原菌。具体方法为:将叶片和叶柄用灭菌水冲洗干净,稍微晾干,切取叶片和叶柄病健交界处3 mm×3 mm大小的组织块,先用75%乙醇消毒15 s,随后置于1%次氯酸钠溶液中浸泡1～2 min,最后用无菌水漂洗3次,用灭菌滤纸吸干水分后置于含50 μg/mL氨苄青霉素和100 μg/mL利福平的V8培养基上,放入25℃恒温培养箱中黑暗培养5 d,待菌落长出后进行单孢分离纯化[18],纯化后接种于V8斜面培养基,置于13℃保存备用。

1.3 致病性测定

按照柯赫氏法则,采用游动孢子悬浮液接种离体叶片以测定菌株致病性。从田间摘取健康且长势较为一致的槟榔芋叶片带回实验室,用70%乙醇对叶片表面进行消毒。将供试菌株接种于V8平板上,25℃黑暗培养5 d,加入灭菌水诱导游动孢子释放,配制成3×104个/mL的游动孢子悬浮液,在每张叶片背面左半部分选取两个点滴10 μL游动孢子悬浮液,右边以灭菌水为对照,放入托盘中保湿,25℃黑暗培养,逐日观察叶片发病情况。待发病后进行病原菌的再分离。

1.4 形态学观察

将纯化的菌株接种于V8平板上,置于25℃黑暗下培养5 d,观察菌落形态特征,参照郑小波[19]、陆家云[20]的方法测量孢子囊的大小。将纯化的菌株同时和辣椒疫霉标准交配型A1、A2菌株对峙培养以诱导有性器官雄器、藏卵器和卵孢子产生,在显微镜下观察各个有性器官形态并拍照测量,每种性器官至少测量50个数据。

1.5 病原菌分子生物学鉴定

采用CTAB法提取病原菌菌丝体DNA,分别使用核糖体内部转录间隔区ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[9]、三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因Ypt1引物Yph1F(5′-CGACCATKGGTGTGGACTTT-3′)/Yph2R(5′-ACGTTCTCMCAGGCGTATCT-3′)[11]、β微管蛋白基因β-tubulin引物BT5(5′-GTATCATGTGCACGTACTCGG-3′)/BT6(5′-CAAGAAAGCCTTACGACGGA-3′)[12]对菌株进行PCR扩增,PCR反应体系(50 μL)为:10×PCR Buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL,5 U/μLTaq酶0.5 μL,ddH2O补足至50 μL。反应程序:94℃预变性3 min;94℃变性25 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸5 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,送至擎科生物(长沙)技术有限公司进行测序。将所得序列提交到NCBI数据库,并进行Blastn比对,下载邻近属种序列,使用Bioedit 软件对序列进行整理,将各基因序列首尾串联,使用ClustalX工具对多基因序列进行比对,应用MEGA 7.0软件邻接法(neighbor-joining,NJ)构建多基因系统发育树。

1.6 供试菌株对7种杀菌剂的敏感性测定

采用菌丝生长速率法[21]测定槟榔芋疫病病原菌对7种杀菌剂的敏感性。将杀菌剂配制成不同浓度的母液,并按照1∶1 000的比例制成系列质量浓度的含药PDA平板。将供试菌株于PDA平板上活化,于25℃黑暗下培养6 d,用直径5 mm的打孔器打取菌饼,将菌丝面朝下接种于含药平板中央,以无药平板为对照,每个处理重复3次,置于生化培养箱中25℃黑暗培养7 d,采用十字交叉法测量菌落直径,计算菌丝生长抑制率。利用SPSS 17.0软件求出EC50、b±标准误差、卡方值和P值。

2 结果与分析

2.1 槟榔芋疫病田间症状观察及致病性测定

田间调查时发现,槟榔芋疫病主要危害叶片,开始产生水渍状斑点,随后迅速扩展为大的褐色轮纹状病斑,病斑周围分泌出淡黄色的小液滴,中间腐败穿孔,仅留叶脉呈破伞状(图1a-c),部分叶柄上也有病斑出现。

本次共采集了20片叶片和10个叶柄,最终分离纯化获得3株菌株,分别命名为JJYT-1、JJYT-2、JJYT-3,将分离纯化的病原菌接种健康叶片,接种24 h后叶片开始褪绿,出现圆形水渍状浅褐色病斑,3 d后病斑逐渐扩大,颜色加深,病斑周围有淡黄色晕圈,中间开始腐烂,对照处理无症状(图1d-e)。从发病部位进行病原菌的再分离,获得与原菌株一致的菌,表明接种菌株为引起槟榔芋疫病的病原菌。

图1 槟榔芋疫病的田间发病症状及致病性测定

2.2 病原菌形态学观察

病原菌菌落在V8培养基上呈圆形,边缘整齐,菌落白色,气生菌丝较少。孢子囊主要呈长椭圆形,少部分为卵圆形,顶端具乳突,大小为(39.0～67.3)μm×(21.9～30.6)μm,平均51.6 μm×25.8 μm,长宽比2.0(1.7～2.4)。供试菌株自身未见卵孢子产生,和辣椒疫霉A1标准菌株对峙培养8 d后,在两菌交界处有大量藏卵器、雄器和卵孢子产生。藏卵器呈球形,大小为(26.8～38.4)μm,平均33.1 μm,卵孢子大小为(17.6～31.3)μm,平均26.6 μm,雄器围生,大小为(11.7～17.6)μm×(8.2～16.2)μm,平均14.6 μm×11.4 μm,与郑小波[19]和陆家云[20]描述的芋疫霉形态基本一致。

图2 槟榔芋疫病病原菌形态特征

2.3 分子生物学鉴定

使用ITS、Ypt1、β-tubulin基因通用引物对分离得到的3株菌株分别进行PCR扩增,可分别扩增出约820、415 bp和700 bp的特异性条带。将序列提交至GenBank,JJYT-1菌株获得登录号分别为MT936521、MT977413、MT977414;JJYT-2菌株获得登录号分别为OM108210、OM162131、OM162133;JJYT-3菌株获得登录号分别为 OM108211、OM162132、OM162134。3株菌株的ITS、Ypt1、β-tubulin序列与NCBI上P.colocasiae相关序列相似性均为99%～100%。通过MEGA 7.0构建ITS-Ypt1-β-tubulin多基因进化树,结果表明3株菌株与Phytophthoracolocasiae聚于同一分支(图3)。

图3 基于 ITS、Ypt1和β-tubulin基因构建的槟榔芋疫病病原菌JJYT-1、JJYT-2和JJYT-3的系统发育树

2.4 7种杀菌剂对槟榔芋疫病病原菌的毒力

由表1结果可知:供试的7种杀菌剂对槟榔芋疫病病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用。其中23.4%双炔酰菌胺SC对菌丝生长抑制效果最好,EC50为0.006 μg/mL;96.8%烯酰吗啉TC、0.3%丁子香酚SL、20%氟吗啉WP、500 g/L氟啶胺SC、97%霜脲氰TC对菌丝生长的抑制效果也较好,EC50介于0.094～1.272 μg/mL之间;45%敌磺钠WG对病原菌的抑制效果最差,EC50为56.923 μg/mL,但45%敌磺钠WG除了能抑制菌丝生长速率外,还能抑制菌丝生长量,随着浓度的升高,菌丝量明显减少。

表1 7种杀菌剂对槟榔芋疫病病原菌的室内毒力

3 结论与讨论

国内已有对芋疫病病原菌鉴定的相关报道,王向社等[22]和叶泉清等[2]通过形态学观察和致病性测定将芋疫病病原菌鉴定为芋疫霉;周清平等[8]和陆叶等[9]等通过形态学观察和ITS序列分析将芋疫病鉴定为芋疫霉。然而,Martin等[10]报道ITS难以对部分亲缘关系相近的种如橡树疫霉P.ramorum和假丁香疫霉P.pseudosyringae进行区分,本研究通过形态学观察、致病性测定联合ITS-Ypt1-β-tubulin多基因序列分析对芋疫病病原菌的鉴定方法更加准确和可靠,这是江西省内首次对该病病原菌的鉴定报道。芋疫霉的寄主范围较窄,主要寄主为芋属作物,可通过气流、雨水、带菌球茎等传播,由于该地区的槟榔芋是从外地引进,推测可能是球茎上带有该病原菌造成此次芋疫病的发生。

本研究测定了7种常用杀菌剂对槟榔芋疫病病原菌的抑制作用,结果表明,除45%敌磺钠湿粉外,其余6种杀菌剂抑制效果均较好。在国内现有的研究报道中,对芋疫病化学防治使用时间长、范围广的药剂主要有甲霜灵和烯酰吗啉,但甲霜灵的作用位点β-1,3 葡聚糖酶单个核苷酸位点的突变就能引起病原菌抗药性[23],因此其使用逐渐受到限制。烯酰吗啉以其抑菌活性强、对卵菌有特效、且与甲霜灵等苯酰胺类杀菌剂无交互抗性而受到广泛重视[24],叶泉清等[2]、周清平等[8]和朱敦军[25]开展的田间药剂试验结果表明,50%烯酰吗啉水分散粒剂、50%烯酰吗啉可湿性粉剂、50%烯酰吗啉水分散粒剂对芋疫病的平均防效分别为58.8%、67.9%和79.2%;黄达才[26]的研究表明,80%烯酰吗啉水分散粒剂对芋疫病平均防效在70%以上;本研究室内毒力测定结果表明,芋疫霉对96.8%烯酰吗啉原药十分敏感,EC50值为0.094 μg/mL,这与前人发现烯酰吗啉对芋疫病防效良好的结论基本一致[2,8,25-26]。本研究发现,23.4%双炔酰菌胺悬浮剂对芋疫霉菌丝生长抑制效果优于96.8%烯酰吗啉原药,其EC50为0.006 μg/mL,方辉等[27]的研究表明,250 g/L双炔酰菌胺悬浮剂对芋疫病有较好的防治效果,且显著优于70%甲基硫菌灵可湿性粉剂和70%烯酰·霜脲氰水分散粒剂的常规用药量。双炔酰菌胺是先正达公司开发的新型卵菌病害杀菌剂,也是第一个商品化的扁桃酰胺类化合物,其对抑制孢子萌发具有较高活性,同时也抑制菌丝体的生长与孢子的形成,研究表明,其对卵菌病害如番茄晚疫病和黄瓜霜霉病等具有很好的防治效果[28]。由于芋叶片表面的蜡质,加上芋疫病多发生于高温多雨季节,许多杀菌剂无法吸附在叶片上而导致防效较差[23]。然而,双炔酰菌胺对植物表面的蜡质具有很高的亲和力,耐雨水冲刷,被吸附后的有效成分能够保护整个叶片不受病害侵染[29]。因此,当芋疫病发生时可优选双炔酰菌胺进行防治。此外,0.3%丁子香酚可溶液剂、20%氟吗啉可湿性粉剂、500 g/L氟啶胺悬浮剂和97%霜脲氰原药对芋疫霉菌丝生长抑制的EC50值分别为0.10、0.275、0.703、1.272 μg/mL,这些数据均可为芋疫病田间防治提供一定参考。

本试验仅在室内完成,下一步应开展田间药效试验以验证实际防效。另外,在芋种植过程中,化学防治芋疫病时用药要早,病害零星发生时便应用药,同时应避免长期使用单一药剂,不同药剂的轮换使用及复配剂的使用能有效避免抗药性的发生。此外,也应加强田间水分管理、增大植株间距、间作等,以达到对芋疫病进行综合防治的目的。