宽缨酮对棉铃虫的拒食活性及生长发育的影响

梁 赫, 邵雪花, 秦子昕, 温雪梅, 路 伟*

(1.新疆农业大学农学院,棉花教育部工程研究中心, 自治区农林有害生物监测与安全防控重点实验室, 乌鲁木齐 830052; 2.广东省农业科学院果树研究所,农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室, 广东省热带亚热带果树研究重点实验室, 广州 510640)

棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)属于鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,主要为害棉花、玉米、大豆、马铃薯等农作物,我国棉区与蔬菜种植区均受到其为害,其中西北各省、黄河、辽河以及长江流域的棉区受害严重[1]。棉铃虫暴发期,可造成蕾铃脱落率达到50%以上,影响棉花正常生长,造成巨大的经济损失[2]。目前对棉铃虫的防治主要以化学防治为主,生物防治为辅。但由于长期大量施用化学农药,在对环境造成污染的同时,还使棉铃虫产生了抗药性[3],而生物农药因对人畜安全,对环境污染小[4],已成为目前农药的重点研发方向。印楝素对鳞翅目、直翅目和鞘翅目等多种农业害虫具有良好的拒食效果[5],因其对靶标生物高效,对非靶标生物安全,对环境污染小,易分解和不破坏生态平衡,被认为是最适合于商品化开发的植物源杀虫剂之一[4]。但印楝素目前只能从印楝Azadirachtaindica种子中提取,而种子收获具有一定的季节性,导致印楝素价格昂贵,难以大规模推广应用[6-7]。因此寻找新型环境友好型植物源农药尤为重要。

宽缨酮(eurycomanone,EN)是一种苦木素二萜类化合物,来源于东革阿里Eurycomalongifolia(Jack)的根部[8-9],对抑制脂肪生成,预防肥胖具有一定效果,被广泛用于医学领域[10]。但其农用活性,特别是对昆虫的生物活性却鲜见研究报道。本课题组从东革阿里中分离得到宽缨酮,发现其能损伤小菜蛾Plutellaxylostella口器和中肠,抑制其生长发育[11]。故本文以印楝素(azadirachtin)为对照,研究宽缨酮对棉铃虫的拒食作用和对生长发育的影响,以期为其开发利用提供理论依据,同时也为棉铃虫的生物防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫及饲养

供试棉铃虫由河南省科云生物有限公司提供,使用人工饲料在恒温恒湿光照培养箱中饲养,饲养期间未使用任何杀虫剂。饲养条件为:温度(26±1)℃,相对湿度(70±10)%,光周期L∥D=14 h∥10 h。

饲养流程:将未凝固的人工饲料放入灭菌培养瓶中,待饲料凝固后用细毛笔将初孵幼虫接入扎孔的培养瓶中,垫上一层灭菌纸,防止其逃逸。待棉铃虫幼虫生长到3龄初期时,将幼虫转移到含有人工饲料的培养瓶中单头饲养,化蛹后将蛹取出消毒然后放入养虫笼,成虫羽化后饲喂10%蜂蜜水,并在养虫笼顶部盖上白色纱布供其产卵。每天更换纱布,将带卵纱布放于自封袋中,放于培养箱中培养,待其孵化后按照上述方法继续饲养下一代。养虫所用的工具及器皿在使用前后均严格消毒。

1.2 仪器与药剂

供试仪器:SPX-250B-G型微电脑光照培养箱,上海博迅实业有限公司;体视显微镜(MZ101)、显微镜相机(MSX2),广州明美光电技术有限公司;FB224 电子天平(1/10 000),上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

供试药剂:宽缨酮,纯度≥98%,CAS号:84633-29-4,购于四川省维克奇生物科技有限公司,其化学结构式如图1所示。二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),纯度≥99.8%,购于北京索莱宝科技有限公司;tween-80(A100442-0500),购于上海博格隆生物技术公司;印楝素,纯度≥98%,华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室提供。

图1 宽缨酮的化学结构式

1.3 试验方法

1.3.1宽缨酮对棉铃虫的非选择性拒食活性测定

采用浸渍叶碟法测定[12]。具体步骤:使用打孔器在鲜嫩的甘蓝(京包菜)上打取直径为1.3 cm的圆形叶碟,备用。用二甲基亚砜将宽缨酮和印楝素分别配制成10 mg/mL母液,再用0.3% tween-80水溶液稀释为6.25、12.5、25、50 μg/mL和100 μg/mL 5个浓度。将叶碟放入不同浓度药液中浸渍8～10 s,取出后放于干净玻璃板上自然晾干。以0.3% tween-80水溶液处理的叶碟为对照。取大小一致且饥饿处理4 h的棉铃虫1龄幼虫放于培养瓶中,每瓶10头,为1个重复,每个浓度设3次重复。将1片浸药叶碟放置于培养瓶中,在瓶口处放一张灭菌纸,将已扎孔瓶盖盖紧,防止幼虫逃逸。将培养瓶放置于温度(26±1)℃,相对湿度(70±10)%,光周期L∥D=14 h∥10 h的恒温培养箱中。随时观察对照组叶片被取食情况,待对照组叶片被取食1/2以上,立刻在所有培养瓶中注满水,阻止棉铃虫幼虫继续取食。将棉铃虫幼虫全部剔除,将被取食的叶碟平铺在玻璃板上,做好标记,并拍照扫描,扫描分辨率设置为600 dpi,用于计算取食面积。

1.3.2宽缨酮对棉铃虫的选择性拒食活性测定

叶片处理方法同非选择性拒食活性测定。叶碟分别在浓度为20、50、100 μg/mL的宽缨酮溶液中浸渍8～10 s,以0.3% tween-80水溶液处理为对照。处理组叶片与对照组叶片各取1片,正面朝上对称放于衬有湿滤纸的8.5 cm培养皿两端,在每个培养皿中间,距两片叶片相等距离处接入10头大小一致饥饿处理4 h的棉铃虫1龄末幼虫,为1个重复,每个浓度设3次重复。用保鲜膜封住皿口并在膜上扎数个孔,用封口膜封紧,放于培养箱中培养,24 h后将棉铃虫幼虫剔除,将被取食的叶碟平铺在玻璃板上,做好标记,并拍照扫描,扫描分辨率设置为600 dpi,用于计算取食面积。

1.3.3宽缨酮对棉铃虫幼虫生长发育影响的测定

采用饲料混毒法[13]测定棉铃虫的生长发育指标。称取一定量固体饲料,使用微波炉加热使其熔化,加入宽缨酮溶液使其含量为10 μg/g,充分搅拌使其与饲料混合均匀。选取一定数量的棉铃虫初孵幼虫,分别接入正常饲料及添加宽缨酮的饲料中,待对照棉铃虫幼虫生长至2龄时,分别选取50头幼虫转移至培养瓶中单头喂饲,根据情况及时添加新鲜饲料。每天随机抽取10头幼虫称取体重,称重后将棉铃虫放回继续饲养,直至幼虫化蛹,并记录数据,期间每天拍照;成虫羽化后饲喂10%蜂蜜水,每天观察成虫产卵情况,对照与处理分别随机挑选300粒卵,观察其孵化情况,并记录数据。上述试验重复3次。

1.4 数据的计算方法及统计分析

各处理的非选择性拒食率[14]、选择性拒食率[15]、化蛹率、蛹畸形率、羽化率、成虫的畸形率分别按照以下公式计算。使用Adobe Photoshop CC 2019计算取食面积,使用DPS软件计算拒食中浓度AFC50,使用SPSS 21.0中的单因素方差分析进行统计分析,使用Origin 2017进行统计分析及作图。

害虫取食面积(S)=单个叶碟面积-剩余叶碟面积=πr2-πr2/A×剩余叶碟像素值=πr2(1-剩余叶碟像素值/A),其中r为叶碟的半径,A为空白处理组单个叶碟的像素值。

非选择性拒食率=(对照组取食叶面积-处理组取食叶面积)/对照组取食叶面积×100%=[1-(A-处理组剩余像素值)/(A-对照组取食像素值)]×100%;

选择性拒食率=(对照组取食叶面积-处理组取食叶面积)/(对照组取食叶面积+处理组取食叶面积)=(处理组剩余像素值-对照组剩余像素值)/[(A-对照组剩余像素值)+(A-处理组剩余像素值)]×100%;

化蛹率=化蛹的试虫数/试虫总数×100%;

蛹畸形率=畸形蛹数/总化蛹数×100%;

羽化率=羽化的试虫数/化蛹数×100%;

成虫畸形率=畸形的成虫数/羽化的试虫数×100%;

孵化率=孵化的卵粒数/卵粒总数×100%。

2 结果与分析

2.1 宽缨酮与印楝素对棉铃虫幼虫的拒食活性

宽缨酮和印楝素对棉铃虫1龄幼虫的拒食中浓度分别为12.04 μg/mL和21.62 μg/mL(表1)。印楝素处理的拒食中浓度比宽缨酮处理组高0.80倍,宽缨酮对棉铃虫的拒食活性显著高于印楝素。图2表明:宽缨酮对棉铃虫具有明显拒食效果,其拒食效果与印楝素相似,浓度越高拒食效果越明显。

图2 宽缨酮和印楝素对棉铃虫1龄幼虫的拒食活性

表1 宽缨酮与印楝素对棉铃虫1龄幼虫的拒食活性测定

宽缨酮浓度为20、50、100 μg/mL时的拒食率分别为34.49%、57.93%、66.87%(表2),选择性拒食活性随浓度增加而增加,3个浓度处理间存在显著差异(F2,6=56.25,P<0.05)。与对照相比，宽缨酮浓度越高对棉铃虫的选择性拒食效果越明显(图3)。

表2 宽缨酮对棉铃虫的选择性拒食活性1)

图3 宽缨酮对棉铃虫幼虫选择性拒食活性

2.2 宽缨酮对棉铃虫幼虫生长的抑制作用

10 μg/g宽缨酮处理后棉铃虫幼虫的体重显著低于对照组(P<0.05,图4a);处理后第10～12 天,对照组棉铃虫幼虫为5～6龄,而宽缨酮处理组的幼虫仅为3～4龄(图4b),幼虫的体重比对照低87.90%、88.04%和80.74%。可见,宽缨酮处理后可以明显抑制棉铃虫幼虫的生长。

图4 宽缨酮对棉铃虫幼虫生长的影响

2.3 宽缨酮对棉铃虫化蛹时间和蛹重的影响

对照组棉铃虫幼虫从第14天开始化蛹,日均化蛹数量随时间先增加后减少,在第16天和第17天化蛹数量最多,为15头左右。宽缨酮处理的幼虫从第19天开始化蛹,比对照组推迟5 d左右;日均化蛹数量随时间也表现为先增加后减少,在第22天化蛹数量最多,为12头左右,低于对照组的峰值(图5a)。对照组的平均蛹重为0.303 8 g(图5b),约为宽缨酮处理组的1.36倍(P<0.05)。

图5 宽缨酮对棉铃虫化蛹时间及蛹重的影响

2.4 宽缨酮处理后棉铃虫的化蛹率、蛹畸形率、羽化率、成虫畸形率和卵孵化率

宽缨酮处理组棉铃虫幼虫的化蛹率、羽化率和卵孵化率均显著低于对照(P<0.05),分别比对照低26.00、37.39和14.98百分点;而蛹畸形率和成虫畸形率均显著高于对照(P<0.05),分别是对照的2.89倍和3.33倍(图6a)。可见,宽缨酮不仅降低了棉铃虫的化蛹率、羽化率和卵孵化率,同时还提高了蛹和成虫的畸形率。宽缨酮处理造成的棉铃虫成虫畸形主要表现为翅发育不良,不能正常展翅;而蛹的畸形主要表现为不能正常蜕皮或蜕皮不完全,蛹干瘪(图6b)。

图6 宽缨酮对棉铃虫化蛹率、蛹畸形率、羽化率、成虫畸形率和孵化率的影响

3 结论与讨论

棉铃虫作为杂食性害虫,严重威胁我国棉花、玉米、小麦等农作物的生产,造成严重的经济损失[16]。“十三五”期间,农业农村部提出化肥农药“零增长”计划,寻找高效防治棉铃虫的植物源农药迫在眉睫。植物源农药是利用植物本身或次生代谢产物作用于靶标生物[17]的一类生物农药,因其在自然界中易降解,无残留,对非靶标生物安全等特点,成为近几年农药开发的重要方向之一[18]。

目前已发现一些天然产物对棉铃虫具有拒食或抑制其生长发育的作用,如将何首乌Pleuropterusmultiflorus根磨成干粉与饲料(1∶10)混匀,饲喂棉铃虫3龄幼虫,第5 天时对幼虫体重抑制率可达90%,幼虫历期延长6 d[19];菖蒲Acoruscalamus乙醇提取物对棉铃虫3龄幼虫具有明显的拒食作用和抑制生长作用,其拒食中浓度和生长抑制中浓度分别为10.43 mg/mL和7.15 mg/mL[20];黄顶菊Flaveriabidentis干粉的乙醇提取物对棉铃虫幼虫3龄幼虫有明显的拒食和抑制生长发育作用,其24 h的拒食率可达50.49%,药后3 d体重抑制率可达51.44%[21]。茜草Rubiacordifolia处理棉铃虫3龄幼虫后5 d,对虫重抑制率高达89.3%,幼虫历期延长12.6 d,茜草干粉处理棉铃虫后5 d,对体重抑制率高达92.4%,幼虫不能化蛹[22]。与其他植物源农药[23]相似,宽缨酮不直接杀死棉铃虫,而是使棉铃虫拒食导致其取食量下降,生长发育受到抑制,不能正常蜕皮,畸形,不能正常交配繁殖,进而达到控制棉铃虫的作用。

本研究发现,宽缨酮对棉铃虫的拒食中浓度比印楝素低0.44倍左右,该结果与宽缨酮对小菜蛾的拒食中浓度是印楝素对小菜蛾拒食中浓度的1/2结果[11]相似。取食含10 μg/g宽缨酮的饲料,棉铃虫体重增长受到抑制,取食11 d幼虫体重比对照低88.04%,化蛹时间推迟5 d左右,与紫薇Lagerstroemiaindica干粉及其提取物对棉铃虫体重抑制率为80.89%,化蛹时间推迟4.3 d的研究结果[24]相似。但宽缨酮对棉铃虫2龄幼虫表现出明显抑制作用,说明棉铃虫低龄幼虫对药物敏感,推荐在棉铃虫1龄期开始施药[25]。同时,取食含宽缨酮的饲料后棉铃虫的蛹重比对照下降26.53%,这可能是由于幼虫生长受到抑制,化蛹前体重较轻。取食含宽缨酮的饲料后,棉铃虫的化蛹率、羽化率和卵孵化率降低,蛹和成虫的畸形率增加,可能是因为宽缨酮干扰了棉铃虫幼虫的代谢,使其无法积累足够的营养物质用于蜕皮、化蛹与羽化,导致蛹和成虫的畸形[26]。

本研究表明,宽缨酮对棉铃虫具有良好的拒食和抑制生长发育的作用,具备开发成为新型植物源农药的潜力。未来应探寻其作用机理,阐明其作用方式,为将天然产物宽缨酮开发成为新型植物源农药提供理论依据。