辣椒锌指蛋白DnaJ-Like基因家族鉴定及对高温胁迫的表达响应

段敏杰 李怡斐 杨小苗 王春萍 黄启中 黄任中 张世才

（1.重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所，重庆 401329；2.重庆市农业科学院生物技术研究所，重庆 401329）

DnaJ 蛋白是一类分子量为41 kD 的热激蛋白（Hsp40），最早在大肠杆菌（Escherichia coli）中发现，又称为J-蛋白［1］。J-蛋白通常包含4 个功能结构域：N 末端J-结构域、G/F 结构域、锌指结构域（CxxCxGxG）及羧基末端区［2-3］。其中J-结构域具有极其保守的组氨酸/脯氨酸/天冬氨酸（His/Pro/Asp，HPD）三肽，是J-蛋白最核心特征［4］。J-蛋白通常作为伴侣蛋白，与热激蛋白HSP70 结合，参与蛋白质折叠、展开、组装和降解，并维持蛋白质稳定［5］。然而越来越多的研究发现DanJ 蛋白的一些活性并不依赖于完整的J-结构域，如当HPD 三肽发生突变甚至缺失的情况下，DanJ 蛋白仍能保持其活性［6-7］，这类蛋白被划分至J-Like 蛋白。依据拟南芥（Arabidopsis thaliana）的分类方式［8］，该类蛋白可分为三类：具有类似J-结构域的DNAJD 蛋白，具有类似锌指结构域和C 末端结构域的DNAJF 蛋白，具有位于羧基端重复DnaJ CxxCxGxG 或GRXLike（GRL）CxxCx7CxxC 锌指结构域的DnaJ-like 锌指蛋白（DNAJE）［8-12］，DNAJE 蛋白是目前研究最多、最为复杂的一类J-Like 蛋白。

已有研究表明，DNAJE 蛋白在植物光合复合体组装中发挥重要作用，而光合复合体组装对环境干旱、温度、光照等的改变非常敏感，每一种变化都会引起植物氧化还原反应的失衡，进而影响植物抗逆性［13］。最早在玉米（Zea maysL.）中鉴定到一个DNAJE基因BSD2［14］，之后在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中鉴定到同源BSD2基因［15］，该基因能够通过转录后调控rbcl 蛋白，从而促进叶绿体功能的正常发挥。同时，在拟南芥［16-20］、百脉根（Lotus corniculatusL.）［20］等中也鉴定到CYO1、SCO2、ANGULATA7等DNAJE基因，其均与叶绿体发育相关，在维持氧化还原反应和光合作用平衡中发挥作用。Fristedt 等［21］和Lu等［22］研究也发现，DNAJE 蛋白在光系统Ⅱ的维护和光系统Ⅰ积累中发挥特殊作用。目前，所有分离鉴定已知功能的DNAJE 蛋白中，仅THRUMIN1 属于GRL CxxCx7CxxC 型，其他均为DnaJ CxxCxGxG 型锌指蛋白［23］。

植物生长发育过程中会遭受诸多不利环境因子胁迫，如高温、低温、干旱、盐等，导致正常生长发育受阻，从而影响产量和品质［24］。辣椒（Capsicum annuum）为一年生或多年生茄科（Solanaceae）作物，是全球种植面积最大的蔬菜作物和消费量最大的辛辣调味品［25］。辣椒喜温不耐热，最适生长温度为22-28℃，温度超过32℃，会产生不可逆热害症状，导致其生长发育不良，造成减产，严重制约辣椒产业发展［24］。目前在辣椒中还未见DNAJE基因家族的相关报道，辣椒全基因组测序数据［26］的公布为辣椒DNAJE基因家族的鉴定和分析提供了条件。

本研究对辣椒DNAJE基因家族进行鉴定，系统分析基因结构特点、进化关系、启动子顺式作用元件、共线性关系及不同组织器官的表达模式等，并研究其在高温胁迫下的生理生化和基因表达特征，为进一步探究辣椒DNAJE基因响应高温胁迫机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为课题组耐热育种骨干亲本862。挑选籽粒饱满一致的辣椒种子，播种于10 cm ×10 cm营养钵中，温室育苗。待幼苗长至5-6 片真叶时转入光照培养箱适应性生长，昼夜温度/光周期设定为26℃/12 h 和22℃/12 h，光照强度4 000 lx，每日定时浇水，控制空气相对湿度为70%。培养3 d 后调整培养箱昼夜温度至40℃/30℃，进行高温胁迫处理，对照组为26℃/22℃，光周期、光照强度、空气相对湿度保持不变。分别于处理0、1、3、5、7、10 d 时取叶片经液氮速冻后，-80℃保存备用。每次取样随机选择10 株，重复3 次。

1.2 方法

1.2.1 辣椒DNAJE基因家族鉴定和特征分析 从国家基因库核酸序列归档系统（CNSA）（https://db.cngb.org/cnsa/）和茄科基因组数据库（https://www.sgn.cornell.edu/） 分别下载辣椒Zunla 1 和番茄（Solanum lycopersicumL.）全基因组数据，构建本地蛋白数据库；从Pfam 数据库（https://pfam.xfam.org/）获得锌指（zinc finger）结构域DnaJ_CxxCxGxG HMM 模型文件PF00684，通过本地Hmmsearch 命令初步筛选获得DNAJE基因家族成员；参考已发表文献［8,10］从拟南芥数据库（https://www.arabidopsis.org/）获得33 个拟南芥DNAJE基因家族成员蛋白序列，与辣椒和番茄蛋白序列进行本地Blastp 比对，收集E-value<1e-5 输出基因，剔除重复序列后，与HMM 检索结果合并；将合并的候选序列上传至Pfam、NCBI CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）及SMART（http://smart.emblheidelberg.de/），基于DNAJE 结构域进一步比对筛选。利用ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）计算辣椒DNAJE 蛋白分子量和等电点，利用WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）在线分析工具进行DNAJE 蛋白的亚细胞定位预测；利用在线软件SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测分析DNAJE 蛋白二级结构。

1.2.2 辣椒DNAJE基因家族染色体定位和比较进化关系分析 基于获取的辣椒基因组注释信息文件，利用TBtools［27］可视化工具构建辣椒染色体定位图；利用MEGA 5.0 软件的邻近法（neighbour-joining,NJ）构建辣椒、番茄和拟南芥DNAJE 进化树，设置Bootstrap 值为1 000，置换模型为P-distance，其他为默认参数；利用在线软件iTOL（http://itol.embl.de/）对进化树进行美化。

1.2.3 辣椒DNAJE基因家族保守基序、基因结构、启动子作用元件分析 利用MEME（https://memesuite.org/meme/tools/meme） 在线软件预测分析DNAJE 蛋白保守motif，motif 最大发现数设定为5个，其他参数默认。利用TBtools 软件分析DNAJE基因结构，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线软件分析基因启动子顺式作用元件，利用MEGA 5.0 构建辣椒DNAJE基因家族系统进化树，方法参数同上，利用TBtools 软件对上述结果进行可视化。

1.2.4 辣椒和拟南芥DNAJE基因家族共线性及RNA-seq 分析 利用TBtools 软件中Fasta stats 和Table Row 功能构建辣椒和拟南芥染色体骨架、DNAJE基因位置，再利用其One step MCscanX（Super Fast）和Advanced circos 插件对辣椒和拟南芥进行共线性分析；从NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45037） 下载叶、花、茎、根及不同时期果实的RNA-seq 数据，提取DNAJE基因家族成员TPM 值并绘制基因表达热图。

1.2.5 辣椒高温胁迫响应相关基因RT-qPCR 分析 利用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme）提取样品总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA 质量，NanoDrop 2000 超微量分光光度计检测RNA 浓度，利用Hiscript Ⅲ 1st strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）试剂反转录合成cDNA；利用Primer 5.0 设计特异性引物，并在NCBI Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/）进行特异性验证，以UBI3为内参基因（表1）。参照ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）试剂操作说明书进行RT-qPCR 分析。采用2-△△Ct算法计算基因相对表达量，使用EXCEL、Origin 2021、SPSS 18.0 软件进行数据分析及作图。

表1 实时荧光定量PCR 引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.2.6 高温胁迫下辣椒幼苗的生理生化响应 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化物酶（peroxidase,POD）和过氧化氢酶（catalase,CAT）活性及丙二醛（malondialdehyde,MDA）、过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）含量测定参照试剂盒说明书（苏州科铭生物技术有限公司）进行操作，采用Thermo MULTISKAN GO 型酶标仪分别测定不同波长下吸光度，计算酶活性或含量，利用EXCEL、Origin 2021 进行数据分析及作图。

2 结果

2.1 辣椒DNAJE基因家族鉴定与分析

本研究在Zunla 1 和番茄基因组中分别鉴定获得28 个和26 个DNAJE基因家族成员，依据其在染色体上的位置将辣椒DNAJE基因命名为CaDNAJE1-CaDNAJE28。对所有CaDNAJE 蛋白理化性质分析结果（附表1）显示，CaDNAJE基因序列开放阅读框（ORF）长度范围为297-1 410 bp，变化范围较大。CaDNAJE 蛋白氨基酸序列长度在99（CaDNAJE23）-470（CaDNAJE18）个之间，分子量变化范围为10.05（CaDNAJE23）-52.26（CaDNAJE18）kD，理论等电点（pI）为4.75（CaDNAJE7）-9.64（CaDNAJE20）。亚细胞定位预测发现，CaDNAJE 蛋白主要定位在叶绿体、细胞核及细胞质。二级结构分析表明（附表2），28 个CaDNAJE 蛋白二级结构完整，以无规卷曲（random coil）和α-螺旋（α-helix）为主。

2.2 辣椒DNAJE基因家族染色体定位和进化关系分析

28 个CaDNAJE基因不均匀分布在辣椒除7 号和8 号染色体之外的10 条染色体上，另外有3 个基因未锚定在染色体上（图1）。其中，1 号和9 号染色体上分布最多，均有5 个；3 号和11 号染色体上各包含3 个；2 号、6 号和10 号染色体上各有2 个；而4 号、5 号和12 号染色体上只有1 个成员。

图1 辣椒DNAJE 基因家族成员染色体定位Fig.1 Chromosomal location of DNAJE gene family members in pepper（Capsicum annuum）

为探讨辣椒、番茄和拟南芥DNAJE基因家族成员之间的进化关系，构建了28 个辣椒、26 个番茄和33 个拟南芥DNAJE 蛋白的系统进化树（图2）。进化结果分为2 个亚族，Group Ⅰ和 Group Ⅱ。Group Ⅰ 有16 个辣椒成员、15 个番茄成员和20 个拟南芥成员，属于DNAJ CxxCxGxG 型DNAJE 锌指蛋白。Group Ⅱ 中有12 个辣椒成员、11 个番茄成员和13 个拟南芥成员，属于GRL CxxCx7CxxC 型DNAJE 锌指蛋白。

图2 辣椒、拟南芥和番茄DNAJE 基因家族成员进化树Fig.2 Phylogenetic tree of DNAJE gene family members in pepper,Arabidopsis and tomato（Solanum lycopersicum）

2.3 辣椒DNAJE基因家族成员保守基序、顺式作用元件及基因结构分析

基于MEME 在线分析软件，在CaDNAJE 蛋白中分析了5 个保守motif（图3-B），基序长度介于15-45 个氨基酸之间（表2）。系统进化树分析结果显示（ 图3-A），Group Ⅰ 中CaDNAJE13 和CaDNAJE25 分别缺失motif 2 和motif 5 基序，其他10 个成员均包含motif 1-motif 5 保守基序；Group Ⅱ所有16 个成员均缺失motif 2、motif 3 和motif 5，只包含motif 1 和motif 4 保守基序。

表2 辣椒DNAJE 蛋白氨基酸保守基序Table 2 Conserved motif of the DNAJE proteins in pepper

基因结构分析表明（图3-C），同一亚族内成员具有相似的基因结构，但不同亚家族间基因结构和内含子数目存在明显差异。Group Ⅰ 中除CaDNAJE2和CaDNAJE26外，均只包含1 个外显子，大部分成员无内含子；Group Ⅱ 中成员具有0-11 个内含子，其中具有4 个以上内含子的占比为56%，CaDNAJE19和CaDNAJE16内含子数目最多，CaDNAJE23和CaDNAJE20只包含1 个内含子，CaDNAJE27无内含子。

利用在线工具对该家族基因启动子顺式作用元件进行预测，结果如图3-D 所示。多个CaDNAJE基因启动子区富集了光响应（GATA-motif、G-box）、MeJA 响应（TGACG-motif）、脱落酸响应（ABRE）、水杨酸响应（TCA-element）、MYB 结合位点参与干旱诱导（MBS）、低温响应（LTR）、防御与胁迫响应（TC-rich repeat）、昼夜节律调节（circadian）等顺式作用元件。其中，TGACG-motif 和ABRE 较多，而MSA-like 和TGA-element 分别仅在CaDNAJE15和CaDNAJE20中被检测到。

图3 辣椒DNAJE 基因家族保守基序、基因结构和顺式作用元件分析Fig.3 Analysis of conserved motifs,gene structure and cis-acting elements of DNAJE gene family in pepper

2.4 辣椒与拟南芥DNAJE基因家族成员共线性分析

共线性分析结果（图4）显示，辣椒和拟南芥之间有10 对DNAJE共线性基因，辣椒中9 个对应拟南芥中10 个DNAJE基因。分别为CaDNAJE1/AT4G10630、CaDNAJE4/AT5G06470、CaDNAJE4/AT3G11773、CaDNAJE7/AT3G28850、CaDNAJE8/AT5G61670、CaDNAJE10/AT4G13670、CaDNAJE11/AT1G75690、CaDNAJE13/AT5G58530、CaDNAJE18/AT5G03870、CaDNAJE21/AT2G41330 直系同源基因对。其中，CaDNAJE4基因在拟南芥中有2 个共线性基因，表明该基因发生了扩张。此外，在辣椒中仅有CaDNAJE12/CaDNAJE21之间存在共线性关系，表明该基因家族种内共线性基因较少。

图4 辣椒和拟南芥DNAJE 基因家族共线性分析Fig.4 Collinearity analysis of DNAJE gene family between pepper and Arabidopsis

2.5 辣椒DNAJE基因家族表达模式分析

利用GEO Datasets 中的转录组数据，对辣椒DNAJE基因家族组织特异性表达模式进行分析，结果如图5。辣椒DNAJE基因在不同组织及果实中有明显表达差异，28 个基因可以分为4 类。CaDNAJE1、CaDNAJE4、CaDNAJE6等A 类基因在辣椒各组织中表达量都很低甚至不表达，多数为Group Ⅱ 基因；B 类4 个基因中仅CaDNAJE26在叶和花芽中表达量相对较高；C 类CaDNAJE 5、CaDNAJE 27、CaDNAJE 23等基因在花和幼果中高表达；D 类基因多数为Group Ⅰ 基因，除CaDNAJE2、CaDNAJE10、CaDNAJE20在0-1 cm 幼果或叶和花芽中几乎不表达外，其他基因在各组织中均高表达。

图5 DNAJE 基因在辣椒不同组织及果实发育过程中的表达分析Fig.5 Expression profile analysis of pepper DNAJE genes in different tissues and fruit development

2.6 辣椒高温胁迫响应基因的表达分析

通过分析NCBI SRA 数据库中辣椒高温胁迫转录组数据（SRP187794），对表达显著差异的12 个CaDNAJE基因和3 个Hsf/HSP 耐热相关基因进行高温胁迫RT-qPCR 分析（图6）。其中，CaHSP22、CaHSP16.4和CaHsfB5基因受高温胁迫表达水平极显著升高，随胁迫时间延长，CaHSP22、CaHSP16.4表达呈下降趋势；辣椒DNAJE基因中除CaDNAJE24负向调控辣椒响应高温胁迫，表达水平下调外，其他11 个基因均呈现不同程度的上调表达，但在不同胁迫时期的表达模式有所差异。CaDNAJE2、CaDNAJE3、CaDNAJE13和CaDNAJE21这4 个基因在1 d 时表达水平最高，之后呈下降趋势；CaDNAJE11基因在1、7 和10 d 时表达水平均显著高于对照，且在7 d 时表达水平最高；CaDNAJE15基因在胁迫1、3、5 d 时表达水平基本持平，之后降低；CaDNAJE17、CaDNAJE19、CaDNAJE23和CaDNAJE27这4 个基因表达基本呈现先升后降再升趋势，均在5 d 时达到最高。CaDNAJE基因在高温胁迫下的高表达，表明其作为应激蛋白可能在辣椒响应高温胁迫中起调节作用，以维持辣椒正常的生长发育。

图6 辣椒高温胁迫相关基因表达分析Fig.6 Expression analysis of genes related to high temperature stress in pepper

2.7 高温胁迫下辣椒幼苗的生理生化响应

当植物遭遇高温等逆境胁迫时，会造成体内H2O2积累，威胁植物细胞膜系统，导致膜脂过氧化产物MDA 含量升高。同时，植物自身SOD、POD、CAT 等抗氧化保护酶系统启动，参与植物对外界逆境胁迫的响应。由图7可知，随着高温胁迫时间延长，H2O2含量急剧升高，5 d 达到最高的5.36 μmol/g，之后开始下降；MDA 含量呈上升趋势，10 d 时比处理前增幅437.01%；SOD 酶活性呈先升后降趋势，在3 d 时活性达到顶峰的188.0 U/g，相比对照，3-10 d 酶活性升高幅度为24.7%-66.1%；POD 酶活性整体呈上升趋势，在10 d 时达到最高的3 819.88 U/g，相比对照，3 d 时活性提升幅度最大，为75.5%；CAT 酶活性前期变化不大，但在10 d 时酶活性明显升高，达到276.91 nmol/（min·g），为对照（40.25 nmol/（min·g））的6.9 倍。

图7 辣椒幼苗对高温胁迫的生理生化响应Fig.7 Physiological and biochemical responses of pepper seedlings to high temperature stress

3 讨论

近年来，随着辣椒全基因组数据的公布［26-28］和生物信息学方法的不断完善，研究人员已对辣椒DnaJ［29］、B-BOX［30］、MYB［31］、AP2/ERF［32］等多个基因家族进行了鉴定分析，但辣椒DNAJE基因家族系统鉴定和分析还未见报道。本研究基于Zunla 1全基因组数据，对辣椒DNAJE基因家族进行鉴定，从基因结构特征、系统进化、顺式作用元件、共线性关系、组织特异性表达及高温胁迫响应等多方面进行了分析和研究。

3.1 植物DNAJE基因功能分析

HSP70 是植物主要伴侣蛋白家族之一，在蛋白质量控制中起非常重要的作用。DnaJ 蛋白（HSP40）是HSP70 的共同伴侣，他能识别未折叠的底物并将其传递给HSP70，刺激ATP 酶活性，诱导伴侣构象改变，进而稳定其与底物的相互作用［33］。DNAJE 蛋白拥有类似于DnaJ 蛋白中参与结合底物的锌指结构域［34］，而缺乏典型的J-结构域，能够不依赖HSP70和J-结构域，直接与底物结合发挥作用。已有研究证实，ORANGE 蛋白作为DNAJE 蛋白家族一员，通过转录后调控植物烯合成酶PSY 以及通过抑制细胞核中转录因子TCP14 活性调控色素合成和叶绿体发育［35-37］。本研究在辣椒中鉴定出28 个DNAJE基因，进化分析显示，辣椒、番茄和拟南芥DNAJE 蛋白被划分至2 个亚族，每个亚族中辣椒、番茄和拟南芥成员分布情况相似，说明其具有较近的同源关系。启动子顺式作用元件对基因转录及调控具有非常重要的作用［38］。分析发现，DNAJE基因启动子区域包含大量光响应、激素响应和胁迫应答元件。结果表明，DNAJE基因可能不仅参与光系统调控，也参与了激素响应和胁迫应答。诸多研究已经证实了这点，Amiya 等［13］报道了一个莱茵衣藻DNAJE 类囊体相关蛋白ZnJ6，其能与氧化还原酶、光合蛋白等相互作用，防止因外界环境胁迫使蛋白发生错误折叠和聚集，从而维持氧化还原和光合平衡，提升抗逆性。Hartings 等［39］在拟南芥中分离了HCF222基因，具有二硫化物还原酶活性，参与细胞色素b6f 组装，进而影响PSII 和PSI 光合复合物的合成；Ham 等［40］通过对烟草（Nicotiana tabacum）DNAJE基因Tsip1的研究发现，其能够与Tsi1转录因子互作，激活下游水杨酸反应基因，进而参与烟草抗逆胁迫应答反应。通过共线性分析发现，辣椒和拟南芥具有10 对直系同源基因，且CaDANJE1/AT4G10630、CaDNAJE8/AT5G61670、CaDNAJE10/AT4G13670、CaDNAJE11/AT1G75690、CaDNAJE13/AT5G58530 这5 对不仅进化关系最近，且序列相似度很高。其中，AT5G61670、AT4G13670 和AT1G75690 已分别被鉴定为拟南芥OR［41-42］、pTAC5［43］和LQY1［44］基因，在质体发育、逆境应答及光系统建成等方面发挥重要作用，因此推测辣椒近源基因也具有类似功能。

3.2 辣椒幼苗响应高温胁迫相关基因表达分析

已有研究表明，热激转录因子Hsf 和热激蛋白HSP 是参与植物应激反应的主要通路［45］，CaHsfB5［46］、CaHSP22［47］和CaHSP16.4［48］等基因在辣椒响应高温胁迫中显著上调表达，进而提升辣椒耐热性，这与本研究结果一致。DNAJE 蛋白与典型DanJ 蛋白具有相似的功能，其表达也能够显著提高植物对非生物胁迫的耐受力，从而降低细胞损伤［49］。Lee 等［50］在苜蓿（Medicago sativaL.）中鉴定了一个DNAJE基因MsDJLP，该基因的表达受低温（4℃）和高温（42℃）诱导，通过在烟草中异位过表达MsDJLP基因增强了转基因烟草对低温和高温的耐受力。So 等［51］通过对大豆（Glycine maxL.）DNAJE基因GmDjp1的研究发现，其受多种非生物胁迫诱导，在大肠杆菌中异源表达GmDjp1基因，能够提高大肠杆菌的耐受性，表明GmDjp1可能在细胞热休克应激过程中发挥关键作用。本研究对NCBI SRA 数据库中辣椒高温胁迫转录组数据进行分析，从2 个亚族中挑选出12 个在高温胁迫下表达量具有显著差异的CaDNAJE基因进行RT-qPCR 分析，结果表明，CaDNAJE24在高温胁迫中表达量降低，呈负调控，其他基因表达水平均显著提高，但其在不同胁迫时间的表达量存在差异，这反映出DnaJ-Like基因以不同调控方式参与了植物响应高温胁迫进程。

4 结论

在辣椒全基因组中共鉴定出28 个DNAJE家族基因，进化分析结果分为2 个亚族，同一亚族具有相似的蛋白保守基序、基因结构以及组织特异性表达模式。高温胁迫导致辣椒生理生化改变，并诱导DNAJE基因高表达，表明该家族基因参与了辣椒响应非生物胁迫的生物过程。

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