植物多基因干扰载体体系构建与效用分析

周家燕 邹建 陈卫英 吴一超 陈奚潼 王倩 曾文静 胡楠 杨军

（1.西华师范大学生命科学学院 西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，南充 637002；2.安阳工学院生物与食品工程学院，安阳 455000）

生物体的生长、发育以及衰老等生命活动受到众多基因的调控。然而，调控这些生理生化过程的基因大多属于多基因家族成员，在调控同一生理生化过程中，部分基因之间存在明显的功能冗余。MADS-box 家族中的SEPALLATA（SEP）基因在花瓣、雄蕊、心皮发育中具有决定作用［1］。然而，拟南芥中的SEP基因，包括SEP1（AGL2）、SEP2（AGL4）、SEP3（AGL9）和SEP4（AGL3），其发生单突变或双突变不会引起明显的表型变化，而sep1/sep2/sep3三突变体则会丧失花器官发育的确定性，导致所有花器官转变为萼片，在sep1/sep2/sep3/sep4四突变体中，不定花序的萼片被叶片所替代［2-3］。同时，Yoshida等［4］发现拟南芥AHG3（AtPP2CA）和ABI1均编码蛋白磷酸酶2C（PP2C）蛋白，并参与ABA 信号的调节。然而拟南芥ahg3-1和abi1-1单突变体均表现出ABA 不敏感特性，而双突变体ahg3-1/abi1-1的ABA 敏感性显著强于其单突变体［4-5］。说明MADSbox 和PP2C 等多基因家族中成员基因在调节相关生理生化过程中存在功能冗余［6-8］。在这种情况下，单个的基因突变或者敲除往往难以观察到相应的性状，故不利于研究这些基因的生物学功能。

在研究多基因家族成员的基因功能时，往往需要利用单突变体并通过遗传杂交构建双突变或多突变体的方式来实现多基因功能研究。然而，这个过程复杂且周期较长，需要耗费大量的人力和物力，同时还受到突变体资源的严重限制。目前，研究人员主要通过各种正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）手段解析植物的基因功能，RNAi 技术则是其中最为重要的技术手段之一［9］。RNAi 技术能有效地实现基因沉默，通过抑制基因表达水平来探究目标基因的功能。该技术具有高效性、特异性和可遗传等特点，因而广泛应用于植物基因功能研究［10-14］。然而，传统的RNAi 体系一般只能使1-2 个基因沉默［15］，很难让多个基因同时沉默。虽然，有研究报道通过保守区广泛脱靶来实现多基因干扰沉默，但是其特异性不强，而且靶向目标具有随机性和不确定性［16-18］。因此，构建靶向精准、高效和可控的多基因RNAi 体系，对于同时研究多基因功能，尤其是研究基因间的功能冗余和协同互作具有重要意义。

为了构建有效多基因的干扰体系，本文对载体pCAMBIA1301 进行改造，构建了有效的多基因干扰体系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 载体。A 组PP2C 成员是ABA 信号的负调控因子，成员之间在调控ABA 信号转导过程中存在功能的冗余［4，8］。因此本文选取系统发育关系较为接近的PP2C 家族A组4 个基因，包括Solyc03g121880.2.1（SlPP2C1）、Solyc12g096020.1.1（SlPP2C2）、Solyc08g062650.2.1（SlPP2C3）和Solyc07g040990.2.1（SlPP2C4），作为分析对象，利用本文构建的多基因干扰体系，构建出四基因干扰载体。再通过遗传转化导入番茄中，获得了四基因干扰的转基因番茄植株，并分析了目标基因的干扰效率和转基因番茄种子对ABA 的敏感性，证明本文开发的多基因干扰体系的有效性。本文为靶向精准、高效和可控的多基因RNAi 提供重要工具和技术体系，对于同时研究多基因功能，尤其是研究基因间的功能冗余和协同互作具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本文使用pCAMBIA1301 载体作为构建多基因干扰载体体系的原始载体。使用Micro-Tom 番茄（Solanum lycopersicumcv.Micro-Tom）作为遗传转化材料，用于多基因RNAi 体系的效用分析。实验材料均种植在温度（25±2）℃，光强7 000 Lux，相对湿度80%，光周期14 h/10 h（昼/夜）的温室中。

1.2 方法

1.2.1 构建多基因干扰体系 本文对pCAMBIA1301载体的多克隆位点（multiple clone site，MCS）区域进行改造，构建多基因干扰体系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s。具体构建步骤如下：

（1）pCAMBIA1301m 的构建。首先设计一个包含CaMV 35s 启动子，PDK 内含子和NOS 终止子的表达盒，并命名为RNAi-E-cassette。表达盒中设置3 个MCS，其中MCS1 位于CaMV 35s 启动子和PDK内含子之间，含4 个限制性位点Hind III、XbaI、SalI 和PstI；MCS2 位于PDK 内含子和NOS 终止子之间，含5 个限制性位点KpnI、XmaI、Eco53k I、SmaI 和SacI；MCS3 位于CaMV 35s 启动子5'端上游，含6 个限制位点SpeI、HpaI、StuI、EcoR I、ApaI和AscI。同时，对pCAMBIA1301 载体中T-DNA 区域内的潮霉素抗性基因，用限制性酶AatII 和PspXI酶切去除，替换成卡拉霉素抗性基因。

接下来，在RNAi-E-cassette 表达盒MCS3 和NOS 终止子的3'端下游分别添加限制性位点SwaI和BamH I，将RNAi-E-cassette 改造成RNAi-E-cassette-E。并在RNAi-E-cassette-E 的上游5'端添加一段与pCAMBIA1301 同源的30 bp 序列ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG，在其下游3'端添加另一段30 bp 序列AGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGT，形成一个新的表达盒片段，将其命名为RNAi-E-cassette-E2。

由于原始载体pCAMBIA1301 上隐藏的限制性位点SmaI 可能会影响表达盒的使用。为了去除SmaI 限制性位点，通过人工合成pCAMBIA1301 载体上9 941-10 800 的核酸片段（5'存在AatII 位点GACGTC，3' 存在BstXI 位点CCANNNNNNTGG），将其中9 985 位置的碱基G（位于SmaI 识别位点内）替换为C，并将其命名为Fragment-Delete-SmaI。随后，利用限制性内切酶AatII 和BstXI 酶切除原始pCAMBIA1301 载体上的相应序列，用Fragment-Delete-SmaI 片段替换，将新载体命名为pCAMBIA1301-Delete-SmaI。之后用限制性酶内切酶EcoR I 和Hind III 切除pCAMBIA1301-Delete-SmaI 的MCS，再通过同源重组将RNAi-E-Cassette-E2 连接到pCAMBIA1301-Delete-SmaI 载体上，形成一个新载体，将其命名为pCAMBIA1301m。

（2）pCAMBIA1301s 的构建。使用与pCAMBIA1301m 相同的方法构建pCAMBIA1301s。首先构建表达盒RNAi-E-cassette，随后，将限制性酶切位点SwaI、PmeI 和BamH I 添加到NOS 终止子3' 下游，将RNAi-E-cassette 改造成RNAi-E-cassette-C。然后，在RNAi-E-cassette-C 上游5'端添加一段与pCAMBIA1301 同源的30 bp 序列ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG，在其下游3'端添加另一段30 bp 序列AGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGT，形成一个新片段，将其命名为RNAi-Ecassette-C2。再将RNAi-E-cassette-C2 连接到pCAMBIA1301-Delete-SmaI 载体上，获得了一个新载体，将其命名为pCAMBIA1301s。

（3）多基因盒干扰载体使用方法。本文构建的多基因干扰体系由包括pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 两个载体组成。两个载体均可通过Hind III、PstI、SalI 和XbaI 酶切位点导入目标基因的正向干扰片段，通过KpnI、XmaI、Eco53k I、SmaI 和SacI 酶切位点导入目标基因的反向干扰片段，形成完整的目标基因干扰表达盒。随后，用MCS3 区段内的限制性酶切位点SpeI、HpaI、StuI和NOS 终止子3'端下游的限制性酶切位点PmeI、SwaI 将pCAMBIA1301s 上的完整的目标基因干扰表达盒切下，并连接到pCAMBIA1301m 的35S 启动子之前的SpeI、SwaI、HpaI、StuI 酶切缺口位置，形成双表达盒的四基因干扰载体，同时载体保留下一个从pCAMBIA1301s 切下的表达盒接入的位点，以此实现连续构建完整目标基因干扰表达盒的目的，因此有利于多基因同时干扰或共沉默。

1.2.2 干扰基因筛选及生物信息学分析 本文从番茄数据库（https://solgenomics.net/）筛选到的13个PP2C基因，通过与拟南芥数据库（https://www.arabidopsis.org/）中筛选得到的拟南芥PP2C基因构建PP2C基因的系统发育树。本文用MEGA7.0 中的clustalW 对上述基因的蛋白质序列进行比对分析，并用Neighbor-Joining method 法进行系统树构建，Bootstrap 参数设为1 000；Model/Method 参数设为p-distance；Gaps/Missing Data Treatment 参数设为Pairwise delection。从中选择具有较近的同源关系的4 个PP2C基因，并将它们重新命名：SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4，如表1所示。并通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库的Conserved Domain Search Service（CD search），并结合MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）分析其PP2C 保守结构域，以确定其是否为PP2C 家族成员。

表1 本文分析的4 个PP2C 基因的相关信息Table 1 Information of four PP2C genes used in this paper

1.2.3 四基因干扰载体的构建 为了实现4 个PP2C基因被特异性干扰，同时避开其基因家族的保守功能区域，本文选取这些基因近编码区3'端区域内的250-500 bp 片段作为干扰片段。采用Overlap PCR技术将SlPP2C1和SlPP2C2的干扰片段连接形成一个融合片段（A 片段），SlPP2C3和SlPP2C4的干扰片段连接形成另一个融合片段（B 片段）。然后，将A 片段和B 片段的正向和反向片段分别连接到多基因干扰载体体系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s的正向和反向位点上，形成pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2 和pCAMBIA1301s ：35S∷SlPP2C3-4。接着用SpeI 和SwaI 将35S∷SlPP2C3-4 表达盒从载体pCAMBIA1301s：35S∷SlPP2C3-4 上切下来，连接到载体pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2 上，由此形成双表达盒的pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4 载体。引物设计使用Primer5，在SlPP2C1和SlPP2C3干扰片段的F 引物5'端添加SacI 和SalI（酶切点ACGCGTCGACGAGCTC，同时在SlPP2C2和SlPP2C4干扰片段的R 引物5'端添加SmaI 和XbaI 酶切位点TCCCCCGGGTCTAGA，引物序列见表2。

1.2.4 番茄遗传转化及阳性植株鉴定 将构建的四基因干扰载体pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4，借助农杆菌GV3101 导入番茄Micro-Tom中，获得转基因番茄植株。随后，通过GUS 染色和PCR 对T0转基因植株进行检测。PCR 使用寡核苷酸Loop-JC-F 和Loop-JC-R 作为鉴定引物（表2）。去除T0代假阳性植株后，将鉴定到的阳性植株命名为35S∷SlPP2C1-2-3-4，并对阳性植株分别种植、单株收种。T0代转基因番茄种子经1/2 MS 固体培养基（卡拉霉素，100 mg/L）抗性筛选后，种植在温室中，繁育子代转基因植株，用于进一步的生理生化分析。

1.2.5 RT-qPCR 检测与干扰效率分析 为检测目标基因的干扰效率，取T1（T1-1、T1-2、T1-3、T1-4）和T2（T2-1、T2-2、T2-3 和T2-4）代阳性转基因番茄的成熟叶片，用野生型（WT）番茄叶片作对照，用QIAGEN RNeasy Plant mini 试剂盒（Qiagen，德国）提取总RNA，然后用反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa，日本）将总RNA 样品反转录为cDNA。使用RT-qPCR 技术检测干扰植株中各PP2C基因的表达水平。将上述cDNA 为模板，以SlUBI（Solanum lycopersicum Ubiquitin，NM_001346406.1）作为内参基因（引物序列见表2），用TB Green TM Premix EX Taq TM II（TaKaRa，日本）进行RT-qPCR 分析，以探究多基因干扰植株的干扰效率。使用金斯瑞（https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqmanprimer-design-tool）在线设计RT-qPCR 引物（引物序列见表2）。使用CFX96 Real-Time PCR 仪（Bio-rad，美国），RT-qPCR 程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，39 次循环。实验重复3 次，所得实验数据通过2-ΔΔCt统计分析。RT-qPCR 定量分析时，将WT 中基因的相对表达值设置为1，用转基因植株中基因的相对表达量来表示其基因的表达水平。

表2 本文使用的所有引物Table 2 All primers used in this study

1.2.6 干扰后的番茄转基因植株对ABA 敏感性检测 本文以种子萌发率为指标，分析转基因番茄种子的ABA 敏感性。首先设置不同的ABA 浓度梯度，筛选番茄野生型（WT）种子对ABA 敏感的最适浓度：选取600 颗饱满的番茄WT 种子接种在含有不同ABA 浓度梯度的1/2 MS 固体培养基上，观察和统计种子萌发情况。ABA 设置4 个浓度梯度，分别为1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L 和10 μmol/L，用双蒸水（Mock）处理作对照。每个梯度设置4 次生物学重复，每个重复处理30 颗种子。以种子胚根露白为萌发标准，每天统计萌发率，连续统计9 d。

随后，将上述实验筛选出来的最适浓度（5 μmol/L ABA）用于处理转基因植株种子，双蒸水（Mock）作为对照。新采收的T1代转基因株系（T1-1、T1-2 和T1-3）种子用ABA 处理，萌发条件同上，以WT 种子为对照。通过统计种子萌发率，计算相对萌发率（相对萌发率=ABA（5 μmol/L）处理的种子萌发率/无ABA 处理种子萌发率），获得干扰后的番茄种子对ABA 的敏感性结果。

2 结果

2.1 构建多基因载体体系

为了实现多个基因同时干扰，本文对原始载体pCAMBIA1301（图1-A）进行改造，构建了多基因干扰体系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 载体（图1-B-C）。载体pCAMBIA1301 的T-DNA 区域位于两个转座边界Right Border repeat T-DNA（RB）（2 350-2 374 bp）和Left Border repeat T-DNA（LB）（8 628-8 652 bp）之间，包含一个LacZ 基因和两个35S 启动子，其中LacZ 基因用于蓝白斑筛选，一个35S增强启动子用于驱动潮霉素抗性基因表达，另一个35S 启动子用于驱动GUS 基因表达。T-DNA 区域外含有一个卡那霉素抗性基因标签。pCAMBIA1301被广泛用于农杆菌介导的植物遗传转化，然而该载体只能实现单基因干扰，具有较大的局限性。而本文改造形成的多基因干扰体系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 载体（图1-B-C），能够实现多个基因同时干扰的目的，有利于同时分析多个基因的功能。

多基因干扰体系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 载体的目标基因表达盒中均包含MCS3、MCS1 和MCS2 三个多克隆位点，MCS1 区段内包含黏性末端限制性内切酶位点Hind III、PstI、SalI 和XbaI，用于导入目标基因的正向干扰片段；MCS2区段中具有黏性末端限制性内切酶位点KpnI、XmaI 和SacI，以及平末端限制性内切酶位点Eco53k I和SmaI，用于导入目标基因的反向干扰片段。载体pCAMBIA1301m 的MCS3 区段包含限制性酶切位点粘性末端限制性内切酶切位点SpeI 以及平末端限制性内切酶位点SwaI、HpaI 和StuI，作为下一个表达盒载入的接口。载体pCAMBIA1301s 的MCS3 区段包含的粘性末端限制性内切酶位点SpeI 以及平末端限制性内切酶位点HpaI 和StuI，并在NOS 终止子3'端具有平末端限制性内切酶位点PmeI 和SwaI，用于切取pCAMBIA1301s 载体上完整的表达盒（图1-B-C）。

多基因干扰载体体系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 使用时，需要在目标基因正向干扰片段上，添加MCS1 区段内对应的两个限制性内切酶位点；在反向片段上添加MCS2 区段内对应的两个限制性内切酶位点，才能形成一个完整的干扰表达盒。在实际操作时，需要从PmeI 和SwaI 中选取一个平末端限制性内切酶，与粘性末端限制性内切酶SpeI 组合，才能完整切取pCAMBIA1301s 上的干扰表达盒，再连接pCAMBIA1301m 上，从而实现将两个表达盒串联于同一个干扰载体的目的，同时，也保证在载体pCAMBIA1301s 上始终保留有限制性内酶切位点SpeI、HpaI 和StuI，作为下一个新的表达盒载入的接口，利于多个表达盒重复添加和串联。该多基因干扰体系能有效实现多个基因同时干扰，是同时研究多个基因的功能以及分析功能冗余基因的有效工具（图1-D）。

图1 多基因沉默载体系统Fig.1 Multi-genes silencing system

2.2 干扰基因筛选及生物信息学分析

为了验证多基因干扰体系的有效性，选用ABA 信号转导核心元件PP2C 家族基因作为靶标进行多基因干扰。从番茄数据库筛选到13 个PP2C基因，系统发育树分析结果显示，13 个PP2C基因均属于A 组的PP2C 家族基因，其中4 个基因Solyc03g121880.2.1、Solyc12g096020.1.1、Solyc08g062650.2.1 和Solyc07g040990.2.1 具有较近的同源关系，这4 个基因可能在功能上具有一定关联（图2-A）。进一步分析发现，这4 个基因均具有完整的PP2Cc 超家族所特有的3 个保守区域（图2-BC）。因此，选择这4 个基因作为多基因干扰系统有效性检验的靶标基因，并将Solyc03g121880.2.1、Solyc12g096020.1.1、Solyc08g062650.2.1 和Solyc07g040990.2.1 分别命名为SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4。

图2 四个PP2C 基因的生物信息学分析Fig.2 Bioinformatics analysis of four PP2C genes

2.3 四基因干扰载体构建、转化及阳性筛选

利用多基因干扰载体体系构建了四基因干扰载体pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4（图3-A）。该载体中包含两个完整干扰表达盒，其中第一个表达盒介导SlPP2C1和SlPP2C2的融合干扰片段表达，让SlPP2C1和SlPP2C2基因表达沉默，第二个表达盒介导SlPP2C3和SlPP2C4的融干扰片段表达，实现SlPP2C3和SlPP2C4基因沉默。因此，该四基因干扰载体能实现对4 个基因SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3、SlPP2C4的同时干扰。

通过遗传转化，将四基因干扰载体pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4，导入Micro-Tom番茄，获得四基因干扰番茄。随后，用GUS 染色和PCR 法对四基因干扰的转基因番茄的T0代植株进行阳性鉴定。GUS 染色法鉴定结果显示，T0代的T0-1、T0-2、T0-3 和T0-4 植株的叶片为蓝色（图3-B），而WT 植株叶片为白色。PCR 法验证结果显示4 株T0植株均有清晰的扩增条带，大小与预期结果基本一致（图3-C）。鉴定结果说明4 个目标基因干扰片段均已成功转入番茄体内，T0-1、T0-2、T0-3 和T0-4 均为阳性转基因植株。

图3 SlPP2Cs 干扰载体构建及阳性植株检测Fig 3 Construction of SlPP2 Cs silencing vector and detection of positive plants

2.4 目标基因干扰效率检测

为了探究多基因干扰系统介导下转基因番茄中SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4基因的干扰效率，本文用RT-qPCR 技术检测了这4 个基因在T1和T2代植株中的表达水平。结果显示，在T1（T1-1、T1-2、T1-3 和T1-4）和T2（T2-1、T2-2、T2-3 和T2-4）代四基因干扰番茄中SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4的表达水平远低于WT，这些基因均被显著抑制，其干扰效率均高于70%（图4-A-B），证明经过改造后的多基因干扰体系对目标基因具有良好的干扰效果，且T1和T2代的干扰效率基本一致。

2.5 转基因番茄ABA敏感性分析

为了进一步验证多基因干扰体系的效用性，分析了T2代转基因番茄35S∷SlPP2C1-2-3-4 种子萌发对脱落酸的敏感性。结果显示，与双蒸水（Mock）处理相比，不同浓度ABA 处理均能抑制WT 番茄种子的萌发，而且ABA 浓度越高抑制作用越强（图5-A）。双蒸水处理的WT番茄种子从第1天开始萌发，在4 d 时达到最大萌发率0.948±0.039，其后不再变化。1 μmol/L 与2 μmol/L 的ABA 处理的WT 番茄种子的萌发率变化趋势与双蒸水处理的趋势基本一致，在第1 天时开始萌发，之后分别在第4 天和第5 天达到最大萌发率0.906±0.071 和0.948±0.021。而5 μmol/L 和10 μmol/L 的ABA 处理的WT 番茄种子的萌发明显延迟，分别在接种后第2 和3 天才开始萌发，其中5 μmol/L 的ABA 处理组在第9 天达到最大萌发率0.948±0.021，而10 μmol/L 的ABA 处理组到第9天也未达到峰值。结果表明，ABA 处理能抑制WT番茄种子的萌发，其中5 μmol/L 的ABA 浓度是显著抑制WT 番茄种子萌发的最低有效浓度。因此，本文选择5 μmol/L 为最佳ABA 处理浓度用于进一步分析多基因干扰植株种子萌发对ABA 的敏感性。

使用5 μmol/L 的外源ABA 处理WT 番茄和T2代的多基因干扰番茄T2-1、T2-2 和T2-3 的种子，用双蒸水处理作为对照。结果显示双蒸水处理的T2-1、T2-2 和T2-3 的种子萌发率与WT 无显著差异；5 μmol/L 的ABA 能显著抑制WT 番茄种子的萌发，其萌发率远低于双蒸水处理的WT 种子萌发率。而ABA 处理转基因番茄T2-1、T2-2 和T2-3 的种子萌发率显著高于ABA 处理的WT 种子（图5-B）。为了更为直观地分析转基因番茄种子ABA 敏感性变化的效率，本文计算了相对萌发率（相对萌发率=5 μmol/L ABA 处理萌发率/双蒸水处理萌发率），结果显示转基因番茄相对萌发率远高于WT 相对萌发率。这些结果表明番茄的4 个PP2C的目标基因被同时干扰后，其种子在萌发方面表现出明显的ABA 不敏感性（图5-C）。证明本文经过改造的多基因干扰载体系统能很好地实现多基因的同时干扰，可用于解析基因间功能冗余和研究多个基因的功能。

图5 转基因植株对ABA 敏感性检测Fig.5 Sensitivity test of transgenic RNAi plants to exogenous ABA

3 讨论

植物的生长发育是一个极为复杂的过程，受众多基因的调控，其中往往涉及多基因家族的成员，但其部分成员之间常存在功能冗余［19］。在解析植物生长发育过程中这些基因功能和调控关系时，通常会使用基因敲除或过表达等技术［1，20］。然而，基因间的功能冗余导致单基因敲除的遗传效应难以被检测，从而限制了对这些基因的生物学功能的全面认识［19］。因此，多基因操作体系对于探究基因的功能及其相互之间的功能冗余具有重要意义。传统基因功能分析，如诱变法构建突变体等手段，虽然较为有效，但由于诱变具有不确定性、冗余基因的多突变体获得极为困难、研究周期漫长等缺点，严重阻碍了冗余基因的功能研究［21］。目前，RNAi 等技术作为研究基因表达调控和鉴定基因功能的重要技术，具有效率高和特异性强的特征［22-24］，被广泛运用于拟南芥［25］、大豆［26］、芸薹［27］等植物的研究。但是，传统的RNAi 体系通常针对单基因干扰，对于研究多基因控制的植物性状具有局限性。因此，多基因干扰体系的构建对于同时研究植物的多个基因的功能具有重要意义，尤其对于研究冗余基因的功能极为重要。

本文以pCAMBIA1301 为基础改造获得的多基因干扰载体体系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s，在结构上均包含3 个多克隆位点MCS3、MCS1 和MCS2。该体系能通过MCS1 和MCS2 分别导入目标基因的正向和反向干扰片段，构建完整的目标基因干扰表达盒。pCAMBIA1301m 的多克隆位点MCS3包含黏性末端酶切位点SpeI，以及平末端HpaI、SwaI 和StuI，该多克隆位点为pCAMBIA1301s载体上酶切获得的目标基因表达盒提供接入位点。而pCAMBIA1301s 载体MCS3 上包含酶切位点SpeI、HpaI 和StuI，并在NOS 终止子下游区域包含平末端酶切位点SwaI 和PmeI，能有效保证pCAMBIA1301s 载体上的目标基因干扰表达盒被完整切下，并与pCAMBIA1301m 的MCS3 上的接入位点有效对接，进而实现两个目标基因干扰表达盒串联于同一个干扰载体上。此外，pCAMBIA1301s上完整的目标基因干扰表达盒被切取，并连接到pCAMBIA1301m 上后，仍然保留了酶切位点SpeI 和HpaI 和StuI，作为下一个表达盒接入的位点，从而实现表达盒的重复添加和多次串联，对于研究多基因同时干扰具有重要意义。

在之前的报道中，He 等［28］和Wang 等［29］在动物多基因沉默的研究中，先后开发了可用于多个siRNA 同时表达的pSOK、BSG 和FAMSi 系统，逐步克服了构建周期长，表达效率低，操作复杂和经验依赖性高的难题，实现了多个siRNA 表达盒的快速组装和表达，并广泛应用于动物的多基因功能研究，为开发基于siRNA 的基因治疗技术提供了重要工具，也为本研究提供了重要的经验参考。目前，在植物的基因功能研究中，急需类似的多基因干扰系统，但暂未见报道。此前，陈任等［30］基于根瘤农杆菌（A.tumefaciens）Ti 质粒pBI121 和大肠杆菌（E.coli）质粒pUC18，构建了适用于植物的多基因表达系统pKAFCR80 和pKAFCR100，克服了植物基因表达载体酶切位点有限和目的片段插入困难等技术难题。陈立志［31］利用Cre/loxP 多基因载体重组技术构建系统，将椰子的3 个基因FatB3、LPAAT和KASI进行操作，构建了两基因组合载体FatB3-LPAAT和FatB3-KASI，及三基因组合载体FatB3-LPAAT-KASI，实现了2 个或3 个基因的同时过表达。然而，这些载体系统均为过表达系统，无法实现植物的多基因干扰。本研究所构建的多基因干扰载体体系，在植物中有效地实现了多个基因的同时干扰。此外，该系统具有简单、高效、不易受酶切位点限制等优点，有效地解决了冗余基因的功能研究中，多突变体获得困难和研究周期漫长的难题。

体系的效用性是载体系统应用价值的核心要素，是载体系统广泛应用的前提。He 等［28］和Wang等［29］开发的pSOK、BSG 和FAMSi 系统，通过体内和体外的生物功能验证，鉴定其体系的效用性，并在动物基因功能研究中成功应用。陈任等［30］报道，将3 个甜叶菊葡萄糖基转移酶基因，转移到pKAFCR80 和pKAFCR100 载体系统中，并通过菌落PCR 鉴定了单基因、双基因和三基因表达载体被成功构建。陈立志［31］将载体FatB3-LPAAT、FatB3-KASI和FatB3-LPAAT-KASI转移到拟南芥中，通过PCR 技术成功鉴定到转基因阳性植株，RT-qPCR 分析这些基因在转基因植株中的表达量，并分析了这些基因导入对脂肪酸含量的影响，验证了其系统的有效性。本研究改造获得的多基因干扰载体体系，对4 个基因SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4构建了四基因干扰载体。通过转基因导入番茄后，获得转基因阳性植株35S∷SlPP2C1-2-3-4。进一步分析转基因番茄植株的干扰效率和转基因番茄ABA 敏感性，结果显示多基因干扰后的T1和T2代转基因番茄植株株系中，4 个目标基因的表达水平均显著低于WT 番茄，干扰效率均高于70%。SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4同时干扰显著改变了T2代转基因番茄种子萌发对ABA 的敏感性，导致转基因番茄种子在ABA 处理条件下的萌发率和相对萌发率均显著高于WT。结果表明该多基因干扰体系，能够有效实现多基因的同时干扰，具有特异性和高效性。本研究通过一系列的验证，不仅鉴定了该体系的效用性，并在植物基因功能研究中进行了应用实践。

本研究改造的多基因干扰载体，能在短时间内实现单、双以及多基因的同时干扰，能够有效应用于多基因功能研究，并解析基因间功能冗余。该多基因干扰体系为植物的基因功能研究和基因间的功能冗余解析提供了重要的方法和分子工具。

4 结论

对pCAMBIA1301 载体进行改造，形成多基因干扰载体体系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s，利用该体系对番茄中的PP2C 家族4 个基因SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4构建四基因干扰载体SlPP2C1-2-3-4。通过遗传转化获得四基因干扰的转基因番茄植株35S∷PP2C1-2-3-4。T1和T2代阳性转基因植株中的4 个目标基因的干扰效率均高于70%，并且显著改变了T2代转基因番茄种子萌发对ABA的敏感性。