基因组编辑系统CRISPR—Cas9研究进展及其在猪研究中的应用

刘贵生+吴俊静+乔木++彭先文+梅书棋

摘要：规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）及其相关的蛋白（Cas）原本是细菌抵御病毒的获得免疫系统，人们很快发现其应用潜力，即RNA引导的核酸酶Cas9对靶DNA进行基因组编辑：敲除、敲入、敲降。CRISPR-Cas9是继ZNF、TALENS技术之后的第三代基因组编辑技术，具有突变效率高、成本低、制作简单、能够诱导多位点同时突变等特点。除了基因工程功能外，CRISPR-Cas9系统还具有基因调控、基因组标记功能、大片段删除、全基因组扫描与编辑RNA等，且发展到CRISPR3.0，并继续开发其新应用。从2012年底开始，CRISPR的一系列创新性应用开启了整个基因组编辑研究的革命，成为生命科学领域的技术明星。文章对其最新进展进行了综述，并对其在猪中的应用及潜力进行了展望。

关键词：基因组编辑；CRISPR-Cas9；猪；基因功能；网络调控

中图分类号：R34；S828 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6510-07

最新的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）分类表将其描述为三大类型和多个亚型，结合生物化学与分子遗传学方法揭示了不同CRISPR-Cas（CRISPR associated protein）类型的特征[1]，其中II型系统Cas9比其他更为简便。基于CRISPR-Cas9系统的作用原理，研究人员模拟细菌的成熟crRNA和tracrRNA，在体外人工合成gRNA（guide RNA），同样可以达到特异地切割靶标DNA，从而将该系统简化成核酸酶Cas9和人工合成的sgRNA两个组分，在靶标位点导致所期望的插入、删除或替换，由此开创了新型基因编辑技术，这是该系统的“基因工程功能”。更进一步地，通过点突变得到缺乏核酸酶活性的Cas9突变体，命名为dCas9。突变的dCas9可在gRNA的引导下，实现与DNA结合，但不能切割DNA。而dCas9具有融合异源模块的结构域，利用dCas9这3点特性，将其与一系列具有功能的异源模块融合，实现不同研究目的：转录激活与抑制、探索未知基因及其调控元件的功能、全基因组扫描等，这是该系统的“基因调控功能”。不论是基因工程/基因调控，其工作过程是相同的：gRNA通过序列互补原则将核酸酶带到基因组特定位点，使其与靶标结合。不过，基因工程与基因调控是利用Cas9蛋白的不同形式，包括野生型Cas9与人工突变的dCas9蛋白，以实现各自目的[2，3]。该技术能够快速地构建遗传改造的动物，使得在过去要花费数月或数年的工作现在只需几周完成。CRISPR技术与PCR技术类似，正在给生物工程研究带来革命性的改变，从各个方面影响着生命科学的发展[4]。目前基因组编辑CRISPR-Cas中也主要是应用Cas9系统，下面简称“Cas9系统”。

2013年初以来，Cas9系统的快速创新及其拓展应用，使其成为可替代ZFN和TALEN的第三代基因组编辑工具。2013年Science杂志将Cas9系统选为年度十大突破之一（亚军）；2014年美国加州大学伯克利分校生物化学家Doudna博士和德国的Charpentier博士因此共同获得了美国硅谷“科技突破奖”与“阿尔珀特奖”；2015年被Science杂志评选为年度十大突破之首；2016年具有小诺贝尔奖之称的盖尔德纳国际奖授予了三位科学家：Doudna，Charpentier和麻省理工学院的张锋三位博士。几大公司看好Cas9系统的成果商业化前景。Editas Medicine、Intellia Therapeutics和CRISPR Therapeutics等公司已经收到数亿美元的投资。例如，2015年比尔·盖茨等大佬宣布为促进基因编辑技术的蓬勃发展，共投资1.2亿美元参与基因编辑公司 Editas Medicine的B轮融资，Cas9先驱之一张锋是该公司的联合创始人。Editas Medicine计划于2017年采用基因编辑疗法对先天性黑蒙症进行临床试验，这是一种罕见的视网膜疾病，基因突变可能导致眼睛中的感光细胞逐渐消失。据麻省理工學院Broad研究所网站最新报道，农业生物技术巨头杜邦（DuPont）公司宣布对Caribou Sciences公司进行投资，且将获得其专利在农作物使用的独家授权。而Caribou Sciences是Cas9技术首创之一Doudna博士实验室的附属公司。目前，杜邦公司正在温室中种植Cas9编辑的玉米、大豆、水稻和小麦，期望在5～10年内出售Cas9技术的产品。位于明尼苏达州圣保罗的动物生物科技公司Recombinetics正在开发同类动物，包括无须抑制牛角生长的牛和不需要被阉割的猪。2016年6月底，美国国立卫生研究院（NIH）顾问委员会批准了一项申请：利用Cas9系统强化依赖于患者T细胞（一种免疫细胞）的癌症疗法。由于其易用性和通用性，Cas9已经被世界各地的实验室用来改写基因组和重塑细胞，其在医学和农业领域的潜在应用是无穷无尽的，它将开启该行业新一波的产品浪潮和利益追逐。根据瑞士洛桑附近的咨询机构IPStudies介绍，全球已有超过860项CRISPR专利，平均每天新增加一项专利。世界许多遗传学家和生化学家普遍认为，Cas9系统可对所有的生物进行改造，这是一项可改变生命未来的伟大技术，当然，该技术也面临许多伦理挑战。

1 CRISPR-Cas9系统的拓展性应用研究

最初的Cas9只能实现剪切的基因工程功能（CRISPR1.0版本）。每次只能执行一种功能的dCas9是CRISPR2.0。现在研究人员将突变dCas9蛋白与一系列具有功能的异源模块融合，成为能够执行多重功能的CRISPR3.0。这种平台能够执行复杂的程序，适用于研究基因网络机理和更深入探讨复杂性状/疾病[5]。

1.1 同时激活多基因表达/同时抑制多基因

Chavez等[2]设计了三方转录激活子（VP64-p65-Rta）融入dCas9，可探讨一连串基因回路对生物过程（比如组织发育或疾病发生）的影响，也可以精确指导干细胞分化，生成再生医学所需的移植器官。Konermann等[6]应用改造后的Cas9系统成功激活了十个基因，包括长非编码RNA（LncRNA）。这些基因转录效率得到了两倍以上的增长，该研究的意义在于，人们可以用这一技术在活细胞中有效启动任何基因表达[7]。Cas9系统已被成功地用于同时干扰小鼠2个基因和敲除猴与蚕的两个基因[8，9]。多位点编辑将促进多方面研究，包括上位效应的检测和基因组中物理距离非常接近的多基因操作。Ma等[10]同时靶向基因家族的多成员（多至8个位点），突变率平均为85.4%。Zalatan等[11]应用架RNA（scaffold RNA，scRNA），成功在酵母中重新定向了一个复杂的多分支的代谢通路，其中一些基因被激活，另一些基因被抑制（CRISPRa/i）。多基因的组合控制可以帮助人们灵活操纵细胞中的通路，例如，改写细胞命运或者设计代谢通路。Cheng等[5] 报道其CRISPR 3.0版本是Casilio，该系统可结合多个蛋白模块，包括基因激活、基因抑制、染色体荧光标记、组蛋白乙酰转移酶等，以实现不同的目的。

1.2 运用Cas9实施表观遗传学编辑

Kearns等[12]报道dCas9-组蛋白脱甲基酶LSD1 在鼠胚胎干细胞中靶向转录因子Oct4的远端增强子，抑制Oct4转录并失去多能性。许多酶能以不同的机制催化DNA去甲基化，其中，TET（Ten-Eleven Translocation dioxygenase）双加氧酶家族有3个成员：TET1、TET2和TET3，催化的5-甲基胞嘧啶氧化，可启动DNA的去甲基化。Xu等[13]首先向传统sgRNAs中插入两个拷贝的噬菌体MS2 RNA元件，构建了修饰后的sgRNA2.0，这有利于Tet1催化结构域（TET-CD），与dCas9或MS2外壳蛋白融合，以靶向基因位点。结果证明，dCas9/sgRNA2.0指导的去甲基化系统能有效地将靶基因去甲基化，可显著上调靶基因的转录，包括RANKL、MAGEB2或MMP2，而且这结果与它们启动子中相邻的CpG岛的DNA去甲基化密切相关。类似的工作与结果也由Choudhury等[14]报道于模式抑癌基因BRCA1启动子。这些结果不仅可以帮助我们理解在特定背景中DNA甲基化如何调节基因表达的机制，而且也使我们能够控制基因表达与功能，并带来潜在的临床效益。表观遗传效应模块的汇总详见文献[15]。

1.3 运用Cas9开展高通量全基因组遗传学筛选

全基因组 CRISPR 筛选克服了传统遗传筛选的缺点，可应用于几乎任何细胞系和任何遗传背景下的筛选[16]。应用其进行遗传筛选的基础是蛋白Cas9修饰后的多种形式融合和sgRNA文库。构建Cas9高通量筛选的文库有两种：阵列文库和混合文库。（1）细胞系中开展遗传学筛选。Wong等[17]创建了Cas9与CombiGEM结合的平台技术，可展望，该平台有着广泛的应用前景，加速系统鉴定控制人类疾病表型的遗传组合，并转化到新药物组合的发现。（2）体内开展遗传学筛选。Ma等[18]将活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶（AID）与dCas9融合成为dCas9-AIDx，在慢性粒细胞中靶标BCR-ABL，鉴定了赋予细胞伊马替尼抗性的已知突变和新突变。Zhu等[19]开发了配对的gRNAs（pgRNAs），产生大片段缺失，应用这种高通量方法确定了51条功能性的lncRNAs，并验证了其中的9个。该方法使科学家们能够快速识别哺乳动物非编码元件的功能。

1.4 光遗传学加CRISPR调控基因表达与靶DNA切割

东京大学和杜克大学基于光诱导的CRY2（色素）和CIB1（蛋白），开发出相似的光遗传学+CRISPR系统，其目的是利用光来开启和关闭基因表达，同时赋予时空控制和可逆性[20-22]。

1.5 通过荧光标记的dCas9对DNA实施标记

Deng等[23]體外构建“dCas9/荧光素”复合物作为探针，可视化基因组位点完全没有引起DNA变性，称为Cas9介导的荧光原位杂交（CASFISH）。dCas9/sgRNA能够在近着丝粒区、着丝粒、G富集端粒和编码基因等位点快速而有效地进行重复DNA元件标记，也适用于初生组织切片的检测。这种技术具有快速、有效、破坏性较少与成本低的特征，为基础研究和遗传学诊断增加了一种非常有潜力的工具。

1.6 CRISPR-Cas9系统同时实现基因工程和基因调控的双重功能

Kiani等[24]开发了Cas9系统一个新策略，能够同时实现基因组工程和基因调控的双重功能。其使用经过改造的gRNA和Cas9蛋白，在切割特定基因的同时调控其他基因的表达。这一技术大大增强了基因组编辑和基因调控的功能性，帮助我们进一步操纵细胞，以揭示重要生命过程背后的复杂机理，比如，癌症耐药性和干细胞分化，或者帮我们设计更高级的人工基因回路。更进一步地，双重功能Cas9可以促进基因工程菌株（例如大肠杆菌）大规模生产化合物和燃料。

1.7 多顺反子基因

Xie等[25]将tRNA与gRNA结合起来，开发合成了一个多顺反子基因，以提高Cas9系统的靶向能力和多重编辑效率，能够在水稻中高效实现多重基因组编辑和染色体片段删除（可达到100%）。Qi等[26]设计多个tRNA-gRNA单元，在玉米中的研究表明，该系统不仅增加靶向位点数目，也能更有效和准确地缺失染色体片段，这对基因功能的完全消除特别是lncRNAs的研究很重要。同时还表明，在一个表达盒中可容纳多达四个tRNA-gRNA单元，用来修饰同一基因家族中的不同成员或同一代谢途径中的不同调控基因。

1.8 Cas9系统应用于多能干细胞

诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）可无限地自我更新，而不会丧失分化成所有细胞类型的能力，且绕过了免疫排斥的障碍。iPSCs在再生医学中具有良好的前景，是用于致病突变原位校正的一种理想细胞群。将CRISPR应用到iPSCs中为纠正遗传缺陷疾病开辟了一条新途径，因为iPSCs很难采用传统的基因打靶策略进行操作，尤其是蛋白质介导的基因组编辑方法[27-30]。

1.9 染色体大片段和lncRNA编辑

Shechner等[31]介绍了以CRISPR-Cas9为基础的基因组靶向技术展示：CRISPR-Display（CRISP-Disp），将gRNA-ncRNA融合，能将大片段非编码RNA带到特定DNA位点，同时不影响dCas9的功能。CRISP-Disp系统可容纳约4.8 kb的RNA结构域，这相当于天然lncRNA的长度。除了lncRNA以外，研究人员还对各种天然和人工非编码RNA进行了测试，表明gRNA可以偶联多个非编码RNA结构域，这些结构域可同时且独立起作用。CRISP-Disp可用来解决如下问题：一个lncRNA片段是如何调控基因表达的？是这个片段的转录本在起作用，还是它本身的序列在起作用？揭示lncRNA在表观遗传学修饰、染色质重塑或者转录调控中做出的贡献。该系统除了研究非编码RNA机理外，对合成生物学来说，CRISP-Disp的灵活性、模块化和多重化特性是很有吸引力的。用CRISP-Disp招募RNA-蛋白复合体到特定位点，可以设计出复杂的基因调控回路。Yoshimi等[32]开发出了两种基因改造新技术：lsODN（long single-stranded oligodeoxynucleotide）和2H2OP（Two-hit two-oligo with plasmid）），来完成相对较长的DNA片段，如GFP（Green fluorescent protein）序列的靶向基因敲入，提高基因编辑的效率。第一种方法是利用lsODNs作为靶向供体。第二种方法是共同注射两个gRNAs作为“剪刀”切割基因组DNA和供体质粒DNA中的靶位点，两个短ssODNs作为“浆糊”连接切割位点的末端。利用开发出的两种基因改造方法，该研究小组成功实现了高效、精确敲入GFP基因，导入了近200 kb的大片段基因组区域，这是采取传统方法不可能做到的。并用人源基因替代了大鼠基因，构建出了基因人源化的动物。这两种基因敲入方法将会提高遗传工程改造的效率。研究人员高度期待这些遗传工程生物将用于药物研发、转化和再生医学等广泛的研究领域。

1.10 研究蛋白质工程

Hess等[33]开发了一种称为重利用体细胞超突变的原位蛋白质工程新技术，命名为CRISPR-X。研究人员利用dCas9召集胞嘧啶脫氨酶（AID）变异体，其携带有经过MS2修饰的sgRNAs，能特异地诱变内源靶标，限制脱靶伤害。它能产生不同点突变的多样文库，同时靶向多个基因组位点，结果从中找到了引发Bortezomib耐药性的已知和新突变。还利用超活化AID变异体，同时诱变了转录起始位点上游和下游的位点。这些结果均表明 CRISPR-X是一种强大的工具，能帮助科学家们创建复杂的原始遗传突变文库，分析完善蛋白质工程。

2 CRISPR-Cas9系统在猪中的研究进展

Cas9系统出现之前，已经有文献报道了其他技术的基因组编辑猪[34]，现在利用Cas9系统的报道层出不穷。这里重点综述Cas9系统在猪研究中的进展，因为猪不仅提供肉食，同时其在生理学、免疫学和基因组学上与人高度相似，器官大小也比啮齿动物有优势。

2.1 功能基因研究

Su等[35]合成sgRNA时用猪U6启动子代替人U6启动子，获得更佳的打靶效率；Wang等[36]显微注射Cas9 mRNA和sgRNA至猪原核期胚胎，筛选出打靶效率最高的sgRNA；He等[37]将携带GFP和红色荧光蛋白（RFP）的Cas9质粒先后转染猪胎儿成纤维细胞，通过双重荧光筛选提高打靶成功效率；吴金青等[38]应用SSA（Single-strand annealing）报告载体，使Cas9系统对猪胎儿成纤维细胞的打靶效率提高5倍左右。八聚体结合转录因子4（OCT4）是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的重要转录因子之一。Kwon等[39]研究表明Cas9系统可针对孤雌胚胎实现基因OCT4的敲除和敲入。Lai等[40]构建了一个猪OCT4的报告系统，其内源性OCT4启动子可直接控制RFP，因此荧光能准确地显示内源性OCT4的激活，并获得了在内源性OCT4基因启动子下游具有tdTomato基因敲入的猪胎儿成纤维细胞（PFF）系。Cas9系统编辑的PFFs被用作体细胞核移植（SCNT）的供体细胞，在SCNT胎儿的囊胚和生殖嵴中检测到了强大的RFP表达，并制备了两头有生命力的基因编辑猪。

2.2 提高生产性能

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）基因对肌肉生长发育具有重要调控作用。Crispo等[41]、Cyranoski[42]、Wang等[43]和张冬杰等[44]利用Cas9系统获得了MSTN基因的双等位基因敲除猪。湖北省农业科学院畜牧兽医研究所Bi等[45]应用Cas9系统制备了无选择标记的MSTN基因敲除克隆猪。首先，利用Cas9系统介导的同源重组敲除猪初生细胞中MSTN的一个等位基因。然后，用Cre重组酶来切除选择标记基因，有效率为82.7%。免疫印迹显示，克隆猪MSTN大约有50%的降低，同时肌原性基因在肌肉中的表达有所增加。组织学显示，肌纤维数量增加，但是肌纤维大小保持不变。超声波检测显示，最长肌大小增加，背部脂肪厚度降低。该研究提供了一种可靠的途径用于家畜良种生产，也提出了一种策略来减少潜在的生物学风险。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的李奎教授领导研究团队，首次利用Cas9系统获得了位点特异性的基因敲入猪模型[46]，得到一个新的基因组“安全港”位点：pH11位点，通过Cas9系统分别在细胞、胚胎和动物体内的该位点插入了大于9 kb的基因片段，实现了稳定高效的基因表达。

分化簇 163（Cluster of differentiation 163，CD163）被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的受体基因，分化簇1D（CD1D）是一类抗原递呈因子。Whitworth等[47]利用Cas9系统分别敲除CD163和CD1D的基因编辑猪；经过蓝耳病毒株攻毒后CD163双等位基因敲除猪未表现出临床症状，具有良好的抗蓝耳病能力。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所利用Cas9系统进行抗PRRSV和抗猪传染性胃肠炎（PEDV）的CD163和CD13双基因编辑猪的制备，正在开展相关验证鉴定工作。这些研究在养猪业引起了高度关注。

2.3 研究人类疾病的动物模型

猪是人类医学研究极佳的动物模型。vWF（von Willebrand factor）的基因是引起人血管性血友病的主因。Hai等[48]应用Cas9系统靶向猪vWF外显子，目的基因插入/缺失突变效率达到 68.8%（11/16）；单等位基因突变和双等位基因突变的vWF抗原水平均极显著低于野生型个体（P<0.01），双等位基因突变个体的凝血时间极显著高于野生型个体（P<0.01）。赖良学课题组运用Cas9系统，针对皮肤白化病相关的酪氨酸酶（TYR）基因、帕金森疾病相关的帕金森疾病Ⅱ型（PARK2）和PTEN诱导激酶1（PINK1）基因，获得了分别敲除这3个基因的体细胞克隆猪，且TYR双等位基因敲除猪表现出白化病；PARK2 及PINK1双等位基因敲除猪的2个靶基因均不表达，成功建立了人类白化病和帕金森综合征两种猪模型[49]。

再如，去除所有主要淋巴细胞的猪是研究人X-染色体连锁的严重联合免疫缺陷（SCID）患者病毒感染和免疫受损发病机理的理想动物模型。破坏IL2RG的猪比啮齿动物敲除IL2RG模型更接近于SCID表型。Lei等[50]利用Cas9系统快速生成双基因RAG2/IL2RG敲除猪，成功建立了人诺如病毒（HuNoV）感染的免疫缺陷的猪模型，因为RAG2/IL2RG缺陷猪缺乏B细胞、T细胞和自然杀伤细胞。Yu等[51]成功地通过Cas9系统在滇南小型猪产生人类DMD疾病动物模型。

2.4 医学生物反应器

猪除了作为人类疾病模型外，也可作为生产人类需要的产品反应器。例如，赖良学课题组利用精确Cas9系统对猪胰岛素基因进行了无痕定点修饰，3头可以分泌人胰岛素的克隆猪，其中2头完全分泌人胰岛素，而不含猪胰岛素；另一头既分泌人胰岛素也分泌猪胰岛素。牛泌乳量大、乳汁活性蛋白的产量高，因此其乳腺是理想的生物反应器，Peng等[52]通过CRISPR技术建立了人血清白蛋白的生物生产器。人成纤维细胞生长因子2（hFGF2）是一种多功能生长因子，在促进组织生长发育、新血管形成和参与组织修复过程中起着重要的作用，但其在人体内的表达量较低。Jeong等[53]借助Cas9系统将该基因导入到牛成纤维细胞的β-casein基因内含子中，为获得表达hFGF2蛋白的基因编辑牛奠定了基础。谷氨酸棒杆菌是工程化应用传统方法（同源重组）批量生产氨基酸的重要生物机体。Cleto等[54]采用CRISPRi降低该菌的基因PGI和PCK的表达高达98%，降低基因PYK高达97%，从而大大增强了L-赖氨酸和L-谷氨酸产品滴度的比率。这种新谷氨酸代谢工程方法只需要3 d时间，表明CRISPRi可用于快速且有效地代谢途径改造，而不需要对基因缺失或突变。

2.5 异种器官移植

据不完全统计，全世界大概有200万人需要器官移植，而器官捐献的数量远远低于需求数量[55]。尤其是老龄化和慢性疾病的多发，更加导致供体器官严重不足。猪被认为是人体异种器官来源的首选动物，因为猪与其他哺乳动物比较，无论从器官大小、生理结构和基因组相似度都更接近于人，因此，上世纪90年代应用猪生产人类器官项目一度在全球受到追捧，但受阻于猪内源性逆转录病毒（Porcine endogenous retrovi-ruses，PERVs）造成的重大医疗风险。哈佛大学利用Cas9系统对猪肾细胞系PK15中所有62个拷贝的PERV pol（多聚酶）基因敲除，使内源性病毒传递给人的风险降低了1 000倍以上[56]。该研究扫除了猪器官用于人体移植的安全障碍，为全世界亟需器官移植的上百万病人带来希望，也重新燃起了大家对异种器官移植的信心。

免疫排斥反应是猪器官移植另一障碍。α-1，3-半乳糖基转移酶（GGTA1）基因与异种器官移植后的超急性免疫排斥反应显著相关，Sato等[57]在猪胎儿成纤维细胞中通过Cas9系统获得了GGTA1双等位基因敲除的细胞系。Li等[58]针对3个与免疫排斥相关的基因GGTA1、胞苷单磷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMAH）和异红细胞糖苷酯合成酶（iGb3S）基因，共转染靶向这2个或3个基因的CRISPR/Cas9-PX330构质粒，最终获得了敲除单个基因及同时敲除2个或3个基因的胎儿或仔猪。利用类似的方法，Estrada等[59]針对猪肝脏细胞分别敲除GGTA1、GGTA1/CMAH和GGTA1/CMAH/β4GalNT2（β-1， 4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2）基因。

3 CRISPR-Cas9系统的前景

CRISPR-Cas9系统在如此短的时间内极大地推动了生物学的各个方面研究，例如基因功能解析、基因治疗、人类疾病动物模型、生物生产反应器和农业动植物优质遗传育种。该技术生成的产品，定向改变但不含外源基因/片段，在验证其安全性的基础上，这种经过“基因组编辑”的产品更容易被消费者接受。理论上它不会带来健康或环境方面的风险，但是否应该受到转基因相关法律的约束，美国和欧盟的态度不一致。作为新兴的基因组编辑技术，有必要进一步完善其特异性、脱靶效应和输送方法，以及如何更好地激活细胞自身的同源重组，并探索新型基因组编辑技术及其应用，例如，新CRISPR-Cpfl系统[60]、新型NgAgo系统[61]；无序列限制的DNA编辑新工具[62]、纳米颗粒技术[63]等等。

農业动植物改良从来都是一个漫长而繁琐的过程，而如今，科学家因为有了CRISPR技术能够快速而轻松地实现。近两年，许多实验室将这种工具应用在动植物和微生物中，以期获得更高产、更适应环境和更优质的品种。有理由相信，CRISPR-Cas9系统将更好的服务于人类，包括动植物育种。

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