P-HPLC法同时测定不同产地不同采收期墨旱莲中6种成分的含量

南敏伦，尹 涵，司学玲，司英奇，张瀚水，龚本义，赵昱玮，赫玉芳*

（1. 吉林省中医药科学院，长春 130012；2. 吉林农业大学，长春 130118；3. 修正药业集团长春高新制药有限公司，长春 130012；4. 吉林省奥普金钻技术检测服务有限公司，长春 130507；5. 长春工业大学，长春 130021；6.长春中医药大学，长春 130117）

墨旱莲为菊科植物鳢肠（Eclipta prostrataL.）的干燥地上部分[1]，又名旱莲草、水旱莲、猪牙草、莲子草、黑墨草。具有滋补肝肾、乌须固齿、凉血止血的功效[1]，广泛分布于广东、广西、江苏、河南、福建等地。墨旱莲化学成分包含黄酮、香豆素、三萜皂苷、有机酸类、噻吩及挥发油[2]，目前《中国药典》2020年版仅以蟛蜞菊内酯单一成分的含量墨旱莲药材的质量进行控制[1，3]，不能全面整体反映墨旱莲药材的质量，并且对产地及采收期的研究相对较少。本研究针对以上情况，采集6个产地18批不同采收期的墨旱莲药材进行系统研究，采用HPLC法对墨旱莲中含有的主要成分咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯进行含量测定[4-8]，初步揭示了不同产地、不同采收期墨旱莲药材中各成分含量有差异，为严格把控墨旱莲药材的质量，资源合理应用，以及该药材更深入的开发研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260（美国安捷伦公司）；BS 124S电子天平（赛得利斯）；MD-400KDE型台式高功率数控超声波清洗器（苏州美达超声仪器厂）。

1.2 试药

咖啡酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703， 纯度：99.7%）； 木犀草苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111720-201609，纯度：94.9%）；异绿原酸B对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111782-201807，纯度：94.3%）；异绿原酸C对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111894-202103，纯度：95.2%）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111520-202005，纯度：99.6%）；蟛蜞菊内酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111885-202105，纯度：97.2%）；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯；实验所用墨旱莲药材于2020年4-6月采自不同产地，由吉林省中医药科学院赵全成研究员鉴定均为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent C18（250 mm × 4.6 mm，5 um）；流动相A相为0.3%甲酸水，B相为乙腈溶液，梯度洗脱：0～10 min A由90%降至85%；10～35 min A由85%降至75%；35～50 min A由75%降至65%；50～70 min A由60%降至30%；70～80 min A由30%降至20%；流速为0.9 mL·min-1；检测波长为340 nm；柱温为30 ℃；进样量10 μL。对照品及供试品溶液色谱图见图1。

图1 六种对照品（A）及样品（B）高效液相色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品咖啡酸10.07 mg、木犀草苷10.76 mg、异绿原酸B 10.85 mg、异绿原酸C 10.46 mg、木犀草素10.17 mg和蟛蜞菊内酯10.36 mg，分别置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分别得到6种对照品储备液；分别精密量取咖啡酸储备液0.25 mL，木犀草苷储备液0.5 mL，异绿原酸B储备液1.0 mL，异绿原酸C储备液1.0 mL，木犀草素储备液1.0 mL，蟛蜞菊内酯储备液5 mL置同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制备得到每毫升含咖啡酸0.010 04 mg、木犀草苷0.020 42 mg、异绿原酸B 0.040 93 mg、异绿原酸C 0.039 83 mg、木犀草素0.040 52 mg、蟛蜞菊内酯0.201 40 mg的对照品混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取墨旱莲药材粉末（过60目筛）1.0 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入约80%甲醇20 mL，超声处理60 min，冷却，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过（0.45 mm），即得。

2.4 线性关系考察

上述对照品混合溶液分别按照2 µL、5 µL、10 µL、15 µL、20 µL 进样测定，以峰面积Y为纵坐标，进样量X（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程（见表1）。说明咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯在线性范围内线性良好。

表1 6个对照品的标准曲线 μg

2.5 精密度试验

取供试品溶液（1号样），连续进样6次，记录峰面积；咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯峰面积的RSD分别为0.85%、0.64%、0.38%、0.72%、0.66%、0.76%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批供试品（1号样）6份，按制备方法，制备得到供试品溶液，按色谱条件进样测定，记录峰面积，计算含量。计算结果表明，咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯含量的RSD分别为0.82%、0.64%、0.59%、1.01%、1.12%、0.75%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液（1号样），分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进行测定，记录峰面积，计算含量，实验结果表明咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯含量的RSD分别为0.48%、0.55%、0.67%、0.84%、0.91%、0.64%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的供试品（1号样）6份，各0.5 g，精密称定，分别加入适量的对照品，按供试品制备方法制备，按照色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率（见表2）。回收率结果表明，6种化合物的加样回收率良好。

表2 加样回收率实验结果

2.9 样品含量测定

取不同产地和不同采收期的墨旱莲样品，制备供试品溶液，测定并计算咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯的含量（见表3）。

表3 不同产地不同采收期墨旱莲中6种成分的含量测定（n= 3） mg·g-1

3 讨论

由于墨旱莲药材中化学成分含有黄酮类、有机酸类、噻吩类等[2]，化学成分具有多样性，只采用甲醇-水、乙腈-水系统不能将有效成分进行有效分离。经过多次试验，以乙腈-0.3%甲酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱，待测样中咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯达到基线分离；采用340 nm为检测波长，目标峰和杂质峰可以达到完全分离；由于咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯等6种化合物剂型差别较大，为了能使各化合物均能完全提取出来，选用不同浓度乙醇及不同浓度甲醇对提取溶剂进行考察，结果表明80%甲醇提取效果更好；同时考察了超声和回流两种提取方法，实验结果表明，两种提取方法各成分提取效率基本一致，由于超声提取方法操作简单，故此选择超声提取；提取时间考察结果显示，在60 min内各目标化合物均可以完全提取。故本实验以80%甲醇为提取溶剂，提取时间为60 min。

本实验对不同产地和不同采收期的墨旱莲药材中的咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯进行含量测定研究，通过实验看出，不同产地的咖啡酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯含量具有明显的不同，同一采收期药材江苏宿迁含量最高。不同采收期实验结果表明，同一产地5月份采收的墨旱莲6种成分的含量最高。由于这几个地区，墨旱莲开花日期基本均在5月份，墨旱莲在花开始开放还未完全开放时有效成分的含量最高，为墨旱莲的采收期的确定奠定基础。

本研究采用建立的含量测定方法对含墨旱莲药材中的6种成分进行含量测定研究，实验结果表明，本方法适合于墨旱莲药材的含量测定，其分离度、耐用性等均符合规定，可以为墨旱莲药材的质量控制研究奠定基础。