化瘀解毒方含药血清对人肺癌A549细胞凋亡的作用及机制

魏征 张俊萍

(1河南省中医药研究院，河南 郑州 450004；2河南中医药大学第一附属医院；3河南中医药大学)

肺癌是全世界范围内死亡率最高的癌症，在癌症死亡人数统计中占比24%，最新数据表明其5年生存率只有19%〔1〕。2019年中国肿瘤的统计数据显示，中国肺癌新发病例78.1万例，死亡病例为62.6万，占癌症死亡人数的27.2%〔2〕。手术、放疗、化疗是治疗肺癌的主要方法，50%以上肺癌患者确诊时已属晚期，失去了手术机会，放化疗便成为晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的主要治疗手段。近年来，靶向药物的出现给NSCLC带来新的希望，但疗效有限〔3〕。因此，近年来肺癌的治疗更强调综合治疗，而中医药因其在临床治疗中的独到作用引起了医学界的瞩目。大量研究表明，中医药在肺癌术后改善患者生存质量、降低复发转移率、延长生存期和调节免疫功能等方面均具有一定的优势〔4〕。

中医辨证论治的最基本原则是“治病必求于本”，并针对病因进行治疗，肺癌是以“瘀毒”为基本病机〔5〕，以此为依据确立了活血化瘀，解毒攻毒为中晚期肺癌的重要治法〔6〕。化瘀解毒方是我们医院常用方，化瘀解毒方所含中药均证实了临床治疗症瘕痞块积证，方中用搜剔破瘀之力较强的虫类药，以达到破瘀血、消积块的目的。前期实验也已经证明，化瘀解毒方能有效抑制胃癌、肺癌等多种细胞的增殖、侵袭和转移〔7，8〕，同时动物实验也给出了相同的实验结果〔9〕。通过促凋亡是杀死肿瘤细胞的主要途径之一，化瘀解毒方的含药血清(HJRMS)能否具有促肺癌凋亡的作用，其机制是什么尚不清楚。因此，探明HJRMS对于肺癌细胞的凋亡作用及其中的分子机制，对于寻找和开发新的抗肿瘤中药意义重大。本实验对HJRMS在肺癌细胞凋亡过程中的作用和作用机制进行研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药品 为了保证试验药效的一致性，药物来源使用配方颗粒剂，确保指纹图谱的一致性。化瘀解毒方配伍为全蝎3 g，天龙3 g，三七粉3 g，半枝莲15 g，广木香3 g。将配方颗粒剂全蝎、天龙、三七粉、半枝莲和广木香(广东一方制药有限公司购买)换算成等效生药量进行配伍。

1.1.2细胞和试剂 人肺癌细胞株A549 ( 中国科学院上海细胞库)；RPMI1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶购自上海碧云天公司；MTT粉剂购自Sigma-Aldrich；Bcl-2、Bad和Caspase-3单克隆抗体购自 Cell Signaling Technology 公司；β-actin和HRP标记的羊抗兔IgG 购自Invitrogen公司；Annexin V-FITC试剂盒购自美天旎公司。

1.1.3仪器设备 多功能酶标仪(美国 PE 公司)；二氧化碳恒温细胞培养箱(美国Thermo公司)；小型垂直电泳槽和十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)成像分析仪(美国 Bio-Rad公司)；多通道流式细胞仪(美国 BD公司)；实时荧光定量PCR仪(瑞士 Roch公司)。

1.2细胞培养 人肺癌A549细胞系购买自中国科学院上海细胞库。肺癌细胞培养在含有10%FBS的RPMI1640培养基中，培养箱设置CO2含量为5%，温度为 37℃。正常培养及传代，细胞长满80%时进行实验。

1.3含药血清的制备 取SPF级大耳白兔9 只，实验前禁食12 h，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算出大耳兔的灌胃剂量，取6只给予化瘀解毒方药30 g/(d·kg)剂量灌胃。对照组3只给予相同剂量的生理盐水，1次/d，连灌1 w。于末次用药后1 h，无菌条件下心脏采血，分离血清(其中包括含药血清和对应的对照血清)，56℃、30 min下补体灭活，-20℃冰箱保存备用。

1.4细胞活力检测实验 人肺癌A549 细胞，重悬成单细胞悬液浓度为3×104个/ml，均匀地接种于96 孔培养板中使每孔细胞数在3 000个左右。孵育过夜，用含有不同浓度HJRMS的培养基(1%，2%，4%，8%，16%，32%)处理，其余孔加含有对照组血清的RPMI1640培养基，继续分别孵育24，48 h。然后，向每个孔中添加20 μl 5%的MTT，并在37℃下孵育4 h。弃上清，每孔加入DMSO 150 μl。全自动酶标仪中速振荡10 min，充分溶解结晶物。490 nm波长，测定每孔的吸光度(A)值。计算细胞生长抑制率公式：抑制率=(1-药物组A/空白对照组A)×100%。并计算出半数抑制浓度(IC50)，确定低剂量组(含2%HJRMS)、中剂量组(含4%HJRMS)、高剂量组(含8%HJRMS)和对照组(含8%对照组无药血清)用于后期研究(低剂量组和中剂量组分别补充不含药血清6%和4%使最终每组的血清总含量一致，下同)。

1.5流式细胞技术 Annexin V-FITC试剂盒用于检测凋亡细胞和死亡细胞。与磷脂酰丝氨酸(PS)结合的Annexin V-FITC对凋亡细胞呈阳性染色，而碘化丙啶(PI)呈阴性染色。分别处理24 h后，将细胞重新悬浮在100 μl 1×结合缓冲液中，数量为106细胞。然后，将10 μl Annexin V-FITC添加到含有106细胞的每根试管中，并将混合物在室温下在黑暗中再培养15 min。然后在使用流式细胞仪进行分析之前立即将PI添加到混合物中，样品上机进行检测。

1.6Western印迹检测 正常培养细胞，后将A549肺癌细胞均匀接种于6孔培养皿中，分别提取每组处理过的细胞总蛋白质，然后用SDS-PAGE在120 V的恒定电压下分离90 min。然后，将蛋白质电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，分别用抗体(Bcl-2、Bad、Caspase-3和β-actin)进行敷育后，用对应的二抗进行敷育，最后用凝胶成像分析系统(Bio-Rad)检测蛋白质条带。

1.7实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR) 正常培养人肺癌A549细胞，消化细胞均匀地接种于6孔板中，孵育12 h后。继续孵育24 h，提取总RNA。Bcl-2、Bad和β-actin 引物由上海生工合成，Bcl-2：正义链5′- TTGCCAGCCGGAACCTATG-3′，反义链5′- CGAAGGCGACCAGCAATGATA-3′，扩增长度为88 bp。Bad：正义链5′- CCCAGAGTTTGAGCCGAGTG-3′，反义链5′- CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3′，扩增长度为249 bp。β-actin：正义链5′- CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反义链5′- CTCCTTAATGTCACGCACG-AT-3′，扩增长度为250 bp。Bcl-2的反应条件：预变性温度 95℃ 6 min; 解链温度95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；扩增温度 95℃ 10 s，62℃ 10 s，72℃ 10 s进行40 个循环。Bad的反应条件：预变性温度 95℃ 6 min; 解链温度95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；扩增温度95℃ 10 s，62℃ 10 s，72℃ 10 s进行40 个循环。β-actin的反应条件：预变性温度 95℃ 6 min; 解链温度95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；扩增温度 95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s进行40个循环。最终用获得的CT值并计算2-ΔΔCt值进行计算分析。用重复测量的每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数即平均 Ct 值，用于目标基因表达的检测，以2-ΔΔCt表示 mRNA 的相对表达量。目标基因△Ct=目标基因 Ct 值-同一样本内参基因 Ct 值。目标基因的相对循环数(△△Ct 值)=处理组的目标基因△Ct 平均值-对照组的目标基因△Ct 平均值。对照组表达量标准化为 1，取 3次实验均数并绘制相对 mRNA 表达量图。

1.8统计学方法 采用SPSS16.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1HJRMS对肺癌A549细胞增殖活力的影响 对照组的A549细胞生长状态良好；与对照组相比较，HJRMS组A549细胞的增殖明显降低了，随着HJRMS浓度的增加，A549细胞增殖被抑制的现象越明显，并呈一定的浓度依赖性。见表1。说明HJRMS对于肺癌A549细胞具有明显的增殖抑制作用，计算出HJRMS对A549细胞的24 h的IC50=15.73。

表1 HJRMS对肺癌A549细胞增殖的影响

2.2HJRMS对肺癌A549细胞凋亡的影响 HJRMS可以明显促进肺癌A549 细胞的凋亡，无论是早期凋亡还是晚期凋亡。随着浓度增高，凋亡的细胞数也随之增加，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3HJRMS对肺癌A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响 HJRMS作用于肺癌A549 细胞后，抑制细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达明显降低，而促进细胞凋亡蛋白Bad和Caspase-3表达显著增高，与对照组

比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

图1 HJRMS对肺癌A549 细胞凋亡相关蛋白的影响

2.4HJRMS对肺癌A549细胞凋亡相关蛋白mRNA的影响 与对照组比较，低、中、高剂量组肺癌细胞中Bad mRNA表达水平明显增高(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 HJRMS对肺癌A549细胞凋亡及相关蛋白的影响和HJRMS作用于A549 肺癌细胞24 h后、Bcl-2和Bad的蛋白和mRNA表达水平

3 讨 论

一种理想的抗癌药物应该能够引起癌细胞的程序性死亡，从而不伤及正常细胞。近年来，中医药已成为抗肿瘤药物研究的热点和候选物质的来源。本研究发现，HJRMS对A549细胞的增殖有明显的抑制作用。此外，流式细胞术的结果还提示HJRMS可增加A549细胞的凋亡，无论是早期还是晚期凋亡。也就是说，HJRMS可诱导肺癌细胞凋亡，从而抑制细胞数量的增加。本文结果表明，HJRMS明显抑制细胞增殖活力。HJRMS能显著促进肺癌细胞的凋亡。随着HJRMS浓度的增加凋亡细胞数明显增加。这些定量分析结果表明，HJRMS的抗肿瘤作用主要是通过促进细胞凋亡从而抑制细胞增殖来实现的。线粒体途径的凋亡指标，线粒体膜电位的变化主要受Bcl-2家族蛋白的调控〔10～12〕。Bcl-2家族包括抑制细胞凋亡的Bcl-2和Bad、Caspase-3等诱导细胞凋亡的蛋白〔13〕。Bcl-2水平的降低导致线粒体膜通透性和细胞色素c释放的改变，从而允许凋亡复合物的形成并激活Caspase家族的蛋白质〔14〕。Caspase-3的激活触发了细胞凋亡的最终过程〔15〕。Western印迹分析显示HJRMS可以抑制Bcl-2蛋白表达，上调Bad和Caspase-3蛋白表达，促进细胞凋亡。本研究提示，HJRMS通过调控Bcl-2和Bad的mRNA表达水平，直接影响相应蛋白的表达。这些数据共同表明HJRMS可能是通过影响Bcl-2和Bad的mRNA水平，影响了Bcl-2和Bad蛋白的表达，激活了线粒体介导的凋亡途径促进了Caspase-3的激活，从而促进肺癌A549细胞的凋亡。这一结论与MTT实验和流式细胞术实验结果完全一致。

综上，HJRMS通过降低Bcl-2的表达，上调Bad和caspase-3的表达，在体外具有明显的凋亡诱导作用。HJRMS是一种具有明显抗肿瘤作用的中药复方血清，有望成为治疗肺癌的一种潜在的抗肿瘤药物。