壮医药线点灸通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节MMP对膝骨性关节炎大鼠的治疗作用

张燕珍 梁超 鲍春龄 陈少萍

(1海口市中医医院，海南 海口 570216；2上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院)

膝骨性关节炎(KOA)是一种退行性疾病，是由于膝关节软骨细胞的增殖和凋亡平衡失调所致，近年来KOA的发病率有上升趋势〔1〕。在细胞凋亡的过程中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(P13K/Akt/mTOR)信号通路起着关键的作用〔2〕。基质金属蛋白酶(MMPs)能够使得软骨细胞外基质被降解，使得软骨细胞暴露在炎性物质中，在KOA中MMPs存在高表达，软骨细胞因此加速凋亡，软骨进而被破坏〔3〕。壮医药线点灸疗法是壮医的特色医技疗法，已经在多种疾病中有长期的实践应用〔4〕。本实验探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路对MMP-13的调节及其进一步影响KOA模型大鼠壮医药线点灸的治疗作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 SD大鼠60只，雌雄各一半，体重140～160 g。按5只/笼进行群养，屏障环境动物室，空气流通，相对湿度60%，光照条件恒定，以基础饲料常规喂养，自由饮水。适应性饲养7 d后，随机数字表法分为：对照组、模型组、药线组，每组20只。整个实验过程遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的相关条款。

1.2主要试剂和仪器 木瓜蛋白酶、二喹啉甲酸均购自阿拉丁上海阿拉丁生化科技股份有限公司，壮医药线由广西中医药大学壮医药研究中心提供，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国云克隆公司武汉云克隆科技股份有限公司，MMP-13(货号：MA5-14238)、PI3K(货号：PA5-83748)、Akt(货号：44-621G)、p-Akt(货号：PA5-36780)和mTOR(货号：PA5-34663)单克隆抗体及相应二抗均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司、PI3K/Akt抑制剂(LY294002，货号：L9908-1MG)购自美国Sigma公司。

1.3建立大鼠KOA模型 参照段文秀等〔5〕的方法制备KOA大鼠模型：选择剃须刀剔除大鼠双膝关节及其周边鼠毛，消毒皮肤表面后，仅对模型组和药线组注射0.2 ml木瓜蛋白酶至双膝关节腔内(第1,4,7天各1次)，对照组注射等量生理盐水，利用KOA疲劳易发生的特点，迫使实验大鼠在动物试验跑台每天至少跑动30 min，2 w后可得KOA大鼠模型。

1.4干预治疗方法〔6〕(1)取穴方法：整体取穴：根据壮医整体治疗原则，每次取肾俞、脾俞、下关元、足三里(双)、食背(双)、趾背(双)、劳宫、涌泉。局部取穴：根据壮医“寒手热背肿在梅，各疾施灸不离乡”的原则，受累关节取梅花穴。(2)操作手法：采用2号药线，点燃后甩动手腕，火焰熄灭，将呈珠状炭火的线头对准应灸部位或经穴快速点灸，如雀啄食，一触即起，此为一壮，一般一穴灸1～3壮。10 d为1个疗程，休息3 d开始第2个疗程，治疗3个疗程。

1.5取材 药线组干预治疗后，处死各组大鼠，手术切开膝关节腔，切取右侧股骨内侧髁处厚度约2 mm关节软骨，将取出的膝关节软骨组织立即进行4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片在-20℃冰箱保存；取炎症关节软骨组织，用于免疫蛋白印迹法检测；剥取右后膝关节软骨后分离软骨细胞，在高糖DMEM培养基(含体积分数10%的胎牛血清)中培养和细胞传代，待细胞传至第2代后行后续实验。取关节腔内提取关节液,并以2 000 r/min 离心10 min用于炎症因子水平测定。

1.6大鼠膝骨关节软骨组织形态观察 将组织切片室温静置15 min，分别经二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，进行苏木素-伊红(HE)染色后，并在光学显微镜下对染色结果进行拍照，观察各组大鼠关节软骨组织形态变化情况。

1.7ELISA检测软骨中炎症因子含量 所取炎症关节软骨组织加入磷酸盐缓冲液(PBS)置于匀浆器中充分研磨，于4℃，2 000 r/min，离心30 min，收集上清液。依照ELISA试剂盒说明书对软骨中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6进行检测。

1.8免疫蛋白印迹法检测相关蛋白表达 用液氮研磨所取炎症关节软骨组织，加入裂解液以提取组织的总蛋白，并采用二喹啉甲酸(BCA)法对蛋白进行定量。取30 μg待测样本蛋白在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，之后把凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入5%脱脂奶粉封闭2 h后加入一抗后于4℃冰箱孵育过夜或于摇床上振摇2 h。其中一抗分别加入MMP-13、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和MMP-13(工作浓度1∶1 000)抗体。再用PBS漂洗3次后，加入相应的二抗孵育2 h。洗膜后在暗室中X线曝光、显影，利用Quality One对蛋白条带灰度进度分析，以β-actin为内参计算样本蛋白相对表达量。

1.9细胞实验

1.9.1软骨细胞制备及干预分组 将仅注射生理盐水大鼠的第二代软骨细胞分为正常组，未进行干预治疗的KOA大鼠第二代软骨细胞分为两组：(1)实验组：仅予以含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养；(2)实验+LY组：培养基中加入50 μmol/L PI3K通路抑制剂LY294002溶液干预(配制方法：5 μmol LY294002溶于100 ml无菌生理盐水中)。

1.9.2免疫蛋白印迹法检测相关蛋白表达 分别收集各组细胞用PBS洗3遍，弃上清。加3倍体积细胞裂解液于冰上裂解后再用超声破碎细胞，离心后取上清，加入等体积上样缓冲液，煮沸后进行如1.8同样操作。

1.10统计学方法 采用SPSS22.0软件，符合正态分布的计量资料多组均值比较用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。

2 结 果

2.1关节软骨组织形态变化 对照组软骨细胞分布均匀，软骨层平整，滑膜结构完整；模型组软骨细胞减少且排列杂乱，软骨层不平整；药线组关节软骨边缘不平整，软骨细胞排列杂乱；药线组软骨细胞增生且分布不均，关节软骨表面不规则欠光滑。见图1。

图1 各组关节软骨组织形态变化(HE染色，×200)

2.2壮医药线点灸对膝骨关节炎症因子的影响 3组关节软骨组织中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平差异均具有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较，对照组和药线组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著降低(均P<0.05)，且与对照组比较，药线组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著升高(P<0.05)。见表1。

2.3壮医药线点灸对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响 3组关节软骨组织的PI3K、p-Akt和mTOR蛋白表达水平差异均具有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较，对照组和药线组PI3K蛋白、p-Akt蛋白和mTOR蛋白相对表达量均显著升高(均P<0.05)，且与对照组比较，药线组PI3K、p-Akt和mTOR蛋白相对表达量均显著降低(均P<0.05)。各组间AKT蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。

2.4壮医药线点灸对MMP的影响 3组关节软骨组织的MMP-13蛋白表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，对照组和药线组MMP-13蛋白的相对表达量均显著降低(均P<0.05)，且与对照组比较，药线组MMP-13蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。见表1、图2。

图2 各组MMP、PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达

表1 各组关节软骨组织中炎症因子含量、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR蛋白及MMP-13蛋白表达水平的比较

2.5抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对MMP蛋白的影响 3组关节软骨细胞中的PI3K、p-Akt、mTOR和MMP-13蛋白表达水平差异均具有统计学意义(均P<0.05)。与正常组比较，实验组和实验+LY组的PI3K、p-Akt和mTOR的蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)，MMP-13蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)；且与实验组比较，实验+LY组PI3K、p-Akt和mTOR的蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)，MMP-13蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。见表2、图3。

表2 各组关节软骨细胞中PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和mmp-13蛋白表达水平的比较

图3 PI3K/Akt/mTOR信号通路对MMP的调节

3 讨 论

KOA是世界上较为常见的关节疾病，是指关节面软骨发生病变及结构破坏，进而出现膝关节活动功能障碍，临床上有膝部酸痛、膝关节肿胀等症状〔7〕，同时有修复能力逐年降低、不可逆等特点〔8〕，且发病群体主要为中老年人，严重损害了中老年人的生活质量。而目前KOA患者除接受耗费人力财力的手术治疗外，暂时没有特别有效的治疗方法，有关壮医药线点灸针对KOA疗法的研究报告还鲜有报告，暂时缺乏实验基础研究和机制研究。

壮医药线点灸法是传统壮医的疗法之一，是壮族人民在长期临床实践中总结出来的独具民族风格的智慧结晶。陈攀〔9〕的研究称，壮医理论认为：人的大病小病都不是凭空而来，是因为气血的平衡关系被打破而导致的，因此气血是壮医尤其关注的因素，在临床上也是通过各种疗法来调节气血的平衡。壮医认为〔10〕，穴位是人体气血进出之处，也是邪毒出入之处，通过药线点灸可以祛毒，进而使气血趋向平衡，从而使人身体健康。以往研究表明，壮医药线点灸法对KOA有一定的疗效〔11〕，KOA与PI3K/Akt/mTOR信号通路有一定联系〔12〕。

此前有多项研究表明〔13～15〕，TNF-α、IL-1β、IL-6能够作为KOA发展过程中的观测指标，判断KOA的进展。本实验结果表明壮医药线点灸法在一定程度上抑制炎症反应，对KOA模型大鼠有一定的治疗作用。PI3K/Akt/mTOR信号通路被认为在细胞发展过程中具有重要的作用，能够调控细胞分化、增殖和凋亡。mTOR作为PI3K和Akt的下游信号分子，当PI3K被激活后，首先募集和激活Akt信号分子，Akt再使得mTOR活化。当PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活后，会促进细胞的增殖，这在KOA中表现为能促进软骨细胞的增殖，抑制软骨细胞的丢失和软骨层的脱落，进而起到治疗KOA的效果。MMPs作为依赖Ca2+、Zn2+等金属离子的一类蛋白家族，可降解除多糖外细胞外的所有基质，这在关节软骨中表现为软骨细胞外基质被降解，进而导致软骨层脱落。研究结果显示〔16〕，在KOA中MMP-13可能是主要影响因子之一。本研究结果提示，PI3K/Akt/mTOR信号通路能够通过下调上游信号分子PI3K最终抑制MMP-13蛋白的表达，这与此前高瑞林等〔17〕研究结果类似。本研究结果显示在KOA中，PI3K/Akt/mTOR信号通路被抑制，MMP-13高表达会导致软骨细胞凋亡加速，进而使得软骨层脱落，炎症加重。

综上，壮医药线点灸法对于治疗KOA有一定的效果，同时提示其作用机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制MMP-13的表达有关，在一定程度上为KOA的临床治疗提供了理论参考。