碱性药物反相高效液相色谱分析的挑战以及改进方法

曹娜,蒋寿剑,李洋*

(1.正大天晴药业集团股份有限公司,江苏 南京 210046;2.正大天晴药业集团股份有限公司 南京研究院,江苏 南京 210046))

据统计,超过70%的药物含有碱性官能团,在生命科学以及医药领域中,碱性化合物的作用举足轻重[1-2]。在反相液相色谱分析中,碱性化合物的分析是一个难题,大家可能经常会碰到类似峰形拖尾、峰宽、峰高较矮、检测灵敏度较差,而增加进样量会导致色谱峰拖尾加剧,柱的效果迅速降低,相邻的成分更容易被拖尾峰包裹等等。另外,在传统硅胶柱上分离碱性化合物会出现严重死吸附,这些问题给分离分析和纯化制备碱性化合物带来了诸多困难[3-4]。另外,强极性碱性化合物(胞嘧啶、吡啶)在普通反相材料上保留时间较短,甚至在死时间出峰,很难将目标分析物与干扰物质分离。对于强极性碱性化合物无保留情况,通常会选择HILIC色谱柱。亲水作用色谱(HILIC)是基于样品中化合物与亲水性固定相之间的相互作用来实现分离,是一种补充反相作用色谱的方法,可以有效地分离强极性化合物[5-6]。与反相色谱相比,HILIC在分离极性化合物方面具有更好的选择性和灵敏度,可以实现强极性化合物的分离。需要注意的是在HILIC模式中经常会出现重现性和峰形问题。重现性问题主要是由于色谱柱没有达到足够的平衡时间,特别对于梯度方法;峰形问题往往和分析物本身的特点有关以及不合适的样品稀释剂所导致[7]。虽然HILIC对大极性化合物有好的保留和分离效果,但是很多强极性碱性化合物无法溶解在高比例的有机相中,这在很大程度上地限制了HILIC的使用。借鉴分离分析和纯化制备多种碱性化合物的经验以及相关文献,主要从流动相和固定相两个方面改进碱性化合物拖尾问题,并提出了一些改进措施。

1 流动相方面

由于硅胶键合相容易溶解在碱性介质中,因此,大多数反相高效液相色谱法采用酸性或中性流动相条件。碱性化合物在酸性或者在中性流动相环境下,由于解离平衡的关系,便会以离子形式存在,带正电荷。碱性化合物解离越容易,其峰拖尾越严重,主要是由游离的硅羟基与解离后的碱性化合作用生成的二级效应所致。改进措施如下:

1.1 改变流动相pH值

减少硅醇基与碱性化合物的离子交换作用的方法是选择低或较高pH值的流动[8]。较低的pH值可以降低硅醇基的电离程度,从而减少与碱性化合物之间的离子交换反应;较高pH值的流动相可以抑制碱性化合物的电离程度,从而降低与硅醇基之间的离子交换反应。选择合适的流动相需要考虑样品性质和分析目的。如果样品中含有大量的硅醇基化合物,则选择低pH值的流动相可能更适合。相反,如果样品中含有大量的碱性化合物,则选择较高pH值的流动相可能更适合。对碱性化合物来说,流动相的pH值不仅仅对峰形,还对保留因子和选择性都有很大影响,一般我们建议碱性化合物的流动相pH值≤2.5,会有比较好的峰形。

盐酸安罗替尼项目中羟胺杂质检测采用ODS色谱柱,乙腈-磷酸盐体系(pH值2.9),效果较好。阿托品是一种具有叔胺结构的化合物,它呈碱性。在ODS色谱柱上,阿托品的保留时间很短。研究人员张国柱等人[9]在实验中使用磷酸将三乙胺溶液的pH值调至7.5,通过改变阿托品的状态,增加其在色谱柱上的保留,从而提高阿托品的分离效果。一般当流动相的pH值高于或低于被分析物的pKa值两个pH值单位时,可以改善峰形的尖锐度,可以使得化合物以99%的比例存在于一种形式下。

1.2 加入“扫尾剂”

可以使用添加剂来调整流动相的酸碱性。例如,可以在酸性条件下加入三乙胺或二乙胺等一些扫尾剂,然后再用酸来调节流动相。在酸性条件下,三乙胺阳离子与游离于键合相中的硅羟基结合,使得碱性化合物与硅醇基之间的相互作用被阻断,从而改善了峰形。然而,当面对比三乙胺更强碱性的化合物时,三乙胺的效果就不那么明显了。需要注意的是三乙胺的碱性很强,当加入三乙胺作为扫尾剂改善峰形的时候,加入三乙胺后的流动相pH值可能超出色谱柱pH值的耐受范围,对色谱柱造成一定损伤,建议流动相中加入三乙胺后再回调至未加入前的pH值。另外,还需要注意三乙胺在210 nm处有一定得吸收,如果液相分析方法中检测波长在210 nm以下检测时需要谨慎使用。

N-(3-氟-4-((7-((1-羟基环丙基)甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基)氧基)-苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺,使用ODS色谱柱(如Phenomenex Luna C18,4.6 mm×250 mm,5 μm或类似效能的色谱柱),流动相磷酸盐缓冲液(将1.36 g的磷酸二氢钾溶解在1 000 mL的水中,然后加入5 mL的三乙胺,再用磷酸调节pH值至2.7)条件检测,效果都较之前不含有三乙胺的流动相体系好很多。

1.3 添加离子对试剂

在化学实验中,我们通常使用碱性离子对试剂。其中比较常见的有高氯酸盐和烷基磺酸盐。烷基磺酸盐包括庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠等。这些试剂在实验中起到调节酸碱度的作用。在酸性环境中,碱性化合物中的阳离子会与烷基磺酸根阴离子结合,形成中性的离子对,使碱性化合物变成中性化合物,并增强疏水性,改善碱性化合物保留性和峰形。

腺苷蛋氨酸有关物质检测中采用ODS色谱柱,以甲酸铵溶液(取甲酸铵0.63 g,庚烷磺酸钠1.4 g,用甲酸调节pH值至2.8,加水稀释至1 000 mL,摇匀)-甲醇(体积比80∶20)为流动相;在盐酸二甲双胍的检测中采用ZORBAX SB-AQ柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),水-乙腈(体积比73∶27)(内含10 mmol/L磷酸二氢钠和5 mmol/L十二烷基磺酸钠)为流动相,增强了ODS柱上目标物质的保留力,峰形也得到了改善;研究人员史鹏杰等人[10]在流动相中加入烷基磺酸钠类离子对试剂,结果发现槟榔中的生物碱分离效果得到明显改善。

1.4 加入缓冲盐

使用缓冲盐的目的主要有两点,其一是使流动相维持在一个相对稳定的pH值条件;其二是使流动相具有足够的离子强度。因此选择缓冲盐的类型和浓度就非常重要。游离硅羟基被高浓度缓冲盐中金属离子“包裹”,并呈正电状态,使得碱性化合物与固定相的二级反应受阻,从而减小了拖尾和改善了峰形。缓冲盐的弱酸根(阴离子)作用是维持流动相体系在一个稳定的pH值环境,提高方法重现性。一般建议缓冲盐浓度比样品浓度高10倍以上,20～50 mmol/L使流动相维持稳定体系。

通常含有叔胺基团系列化合物采用ODS色谱柱,以乙腈-0.1%甲酸体系为流动相,检测结果峰型差,拖尾明显,流动相由乙腈-0.1%甲酸体系改为乙腈-10 mmol/L磷酸氢二铵/50 mmol/L磷酸二氢铵水溶液,峰型改善明显。

2 固定相方面

C18色谱柱是将十八烷基链键合在硅胶上而得到的,是反相液相色谱分析方法中应用最广泛的色谱柱[11-13]。但是由于十八烷基碳链非常长,所以在键合的时候空间位阻非常大,造成键合率不高,这样会有很多硅羟基没有被键合而残留下来。在某些反相液相色谱中,当残留的硅羟基被解离时,会具有阳离子交换活性。这种活性通常在分离碱性化合物时会导致峰形拖尾并且柱效下降。针对些问题,我们可以考虑以下解决办法。

2.1 改善ODS键合相的封尾技术

针对解决碱性化合物拖尾的问题,研究人员近年来致力于改进固定相结构组成。为了进一步降低游离硅羟基的活性,各色谱柱厂家发展了一些更为先进的制造技术,通过适当的封尾、极性基团修饰以及进一步屏蔽活性硅醇基团,可以得到理想的峰形。如Agilent公司利用双封尾技术开发了ZorbaxExtend C18色谱柱,该色谱柱能够在碱性条件下有效地屏蔽硅醇基团。

分析碱性化合物常用色谱柱有Waters Symmetry Shield RP18、Waters ACQUITY UPLC CSH C18,其中Waters Symmetry Shield RP18是采用内嵌极性官能团的方式,作用机理是极性基团是亲水性的,很容易抓取流动相中的水在其表层,从而阻止碱性化合物与硅胶表面残留硅醇基间的作用,能够获得较好的峰形,但pH值2～8耐受范围有限;Waters ACQUITY UPLC CSH C18是一种带电杂化色谱柱,通过利用色谱柱表面的正电荷与碱性化合物溶质之间的静电排斥作用,使碱性化合物不能靠近硅醇基,从而使色谱峰的形态得到改善。

2.2 使用混合模式固定相

混合模式色谱是一种分离技术,它在一根色谱柱上同时利用两种或多种分离机理来实现分离。这项技术可以根据不同样品的特性来进行分离,从而提高分离的选择性,多种保留机理的存在将十分有利于强极性碱性化合物的分离工作[14-19]。有文献指出付红靖等人[20]开发了一种具有亲水性和强阳离子交换功能的毛细管柱,并研究了这一柱体的保留机制,成功地分离出两性化合物肽和微小结构差异的吡啶化合物。Nicola H等[21]制备了在分离高极性碱性化合物样品时具有良好的保留性和选择性,且不会出现峰形拖尾和过载现象的反相/阳离子交换混合色谱柱;刘会娟等[22]制备表面带正电荷的反相/阴离子交换混合色谱柱,同时考察了该色谱柱对碱性化合物的分离情况,结果发现四种小分子碱性化合物(二羟丙茶碱、茶碱、3-硝基苯胺、2-硝基苯胺)以及结构中含有强碱性季铵盐的盐酸阿米替林都具有良好的峰形,无拖尾现象,说明反相/阴离子交换混合色谱柱中的季铵基团对C18残留的硅羟基有屏蔽作用;王晓欢[23]通过在硅胶表面键合巯基,进一步对表面用苯磺酸及苯基进行改性,制备了一种结合了反相、亲水和阳离子交换三种混合模式的固定相,该混合柱同时具有反相疏水、HILIC亲水和离子交换作用,能够成功用于酸性、中性和碱性化合物的分离。目前商业化的混合模式色谱柱如C18/Cation,C8/Cation,C18-Amino,C8-Amino等在市场上已有销售。

3 总结

本文首先对碱性化合物拖尾的根源进行分析,再分别从固相和流动相两个方面进行探讨解决方案。但在实际工作中,对某一碱性药物进行分析检测时,还需要考虑检测目的以及待分析物的极性、溶解性、酸碱性、稳定性,是否含有异构体等因素,综合这些因素确定选择合适的分离方式、固定相、有机相、水相、检测温度、流速等检测条件。

随着色谱填料种类的丰富,特别是混合作用模式填料的出现,分离碱化物的固定相选择性更大。但是从操作使用的通用性和耐用性上,选择一种经过特殊修饰的ODS色谱柱,结合变换流动相组成,仍是改善碱性化合物分析检测的主流选择,特别是对水溶性样品的分析检测。