Connexin43敲降对血红素诱导的星形胶质细胞凋亡和铁死亡的影响

陆聪， 桂如林， 吕广钊， 张志坚， 卢小东， 杨勇

(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013； 2. 广东省人民医院神经外科，广东 广州 510080)

星形胶质细胞(astrocyte，ASC)是中枢神经系统内数量最多的细胞，为神经元提供营养和机械支持。中枢神经系统在遭受炎症、肿瘤、损伤等情况下会出现ASC活化，也称反应性胶质增生[1-4]。ASC之间存在广泛的缝隙连接,连接蛋白(Connexin，Cx)是形成缝隙连接的分子基础，约有20种亚型，ASC、神经元和小胶质细胞分别高表达Cx43、Cx36和Cx32[5]。Cx在细胞膜上形成的同源或异源六聚体中空结构称为连接子，具有半通道功能，介导细胞与细胞外液的物质交换[6-8]。相邻细胞膜上的连接子对接形成缝隙连接通道，允许分子量在1.5 kDa以下的离子、信号分子和神经递质等小分子物质在相邻细胞间传递，形成细胞间离子和代谢物偶联，称为缝隙连接介导的细胞间通讯(gap junctional intercellular communication，GJIC)[9-10]。此外，Cx43还具有非通道相关的间接调控功能：Cx43羧基端可与β-catenin，c-Src，Cyclin E等调节蛋白以及细胞骨架结合，调控细胞的增殖、迁移、分化和细胞极性[11-13]。

铁死亡是指一种铁依赖的程序性细胞死亡。细胞外的无机铁通常是以无毒的Fe3+的形式与转铁蛋白结合，通过细胞膜上的转铁蛋白受体转运进入细胞内。血红蛋白降解产生的血红素是一种强烈的活性氧诱导剂，通过细胞膜上的转运体被转运至细胞内，释放出Fe2+参与芬顿循环，产生大量自由基引起细胞铁死亡[14-15]。

生理状态下，ASC之间通过Cx43形成广泛的细胞间缝隙连接，形成的合胞体样结构对维持中枢神经系统稳态具有重要意义[16-19]。前期研究发现，脑出血后ASC中Cx43表达下调，触发了Yes相关蛋白(YAP)核转位，介导了ASC活化过程中的表型转化[20]。但关于脑出血后ASC中Cx43表达水平对氧化血红素(hemin)诱导的细胞凋亡和铁死亡的影响迄今未见报道。

本研究通过敲降ASC中Cx43表达，观察细胞对hemin损伤作用的反应；通过生信分析，预测Cx43与铁死亡的相关性及可能涉及的信号通路，并进行验证，为后续深入的机制研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SD红皮鼠购自江苏大学实验动物中心，本研究获得广东省人民医院医学伦理委员会批准(No.GDREC2019173A)。Cx43干扰和对照慢病毒(上海汉恒生物科技公司)，具体碱基序列见表1。一步法Tunel细胞凋亡检测试剂盒和活性氧(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(南通碧云天生物技术公司)；丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(南京建成生物技术研究所)。小鼠抗α微管蛋白抗体(武汉博士德生物公司)，兔抗Cx43、YAP、Bcl-2、Caspase3、c-Caspase3抗体(美国CST公司)；兔抗Bax抗体(英国Abcam公司)；兔抗谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)抗体(美国Affinity公司)。RIPA裂解液及HPR标记的羊抗兔二抗(南通碧云天生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 ASC纯化培养 参照文献[21]的方法提取新生SD大鼠的大脑皮层ASC，取出生1～2 d的SD红皮鼠，采用5%异氟烷吸入麻醉后断头处死，75%乙醇浸泡消毒后取脑，显微镜下分离大脑皮层，去除脑膜、血管和海马。剩余的皮层组织转入0.25%的胰蛋白酶溶液中，轻轻吹打，37 ℃消化10 min。采用孔径70 μm细胞滤网过滤组织残渣，收集滤液，1 000 r/min离心5 min收集细胞沉淀，重悬于10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中，置于培养箱内37 ℃、95%湿度和5% CO2条件下培养。当细胞融合时，将培养瓶在37 ℃摇床上以220 r/min振荡1 h，去除小胶质细胞和少突胶质前体细胞。经免疫荧光染色鉴定，通过此法分离培养的ASC纯度超过95%，用于后续实验。

表1 Cx43干扰和对照慢病毒碱基序列

1.2.2 慢病毒感染及干扰慢病毒筛选 ASC以5×103/孔的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁。根据病毒液滴度，分别计算感染复数(multiplicity of infection,MOI)为3，10，60和100时所需的病毒液用量，用完全培养液稀释，并加入终浓度为5 μg/mL的聚苯乙烯，每孔加入相应MOI值的含慢病毒培养液50 μL，4 h后，每孔再加入50 μL不含病毒液的完全培养液(半体积感染法)。病毒感染24 h后，弃去含有病毒液的培养液，换上新鲜的完全培养液，于37 ℃培养箱继续培养。感染72 h后，在荧光显微镜下观察绿色荧光细胞百分比，确定各MOI值的感染效率。选择合适的MOI值用于后续实验。

将ASC按照5×105/孔的密度接种于6孔板中，按照上述慢病毒感染方法，使用对应的MOI值，进行Cx43-shRNA1，Cx43-shRNA2，Cx43-shRNA3和Cx43NC感染。72 h后收集细胞，提取蛋白用于蛋白质印迹检测Cx43表达，鉴定各慢病毒的干扰效率，筛选干扰效率最高的慢病毒用于后续实验。

1.2.3 细胞分组及处理 将ASC按照5×105/孔的密度接种于6孔板中，分为对照组(Control)、溶剂对照组(Vehicle)、hemin组、Cx43NC+hemin组、Cx43KD+hemin组。待细胞贴壁后按照上述慢病毒感染操作进行Cx43-shRNA1和Cx43NC慢病毒感染，48 h后，向各组细胞中加入如下处理因素：对照组为无血清DMEM，溶剂对照组为含有同等稀释度hemin溶剂的无血清DMEM，hemin组、Cx43NC+hemin组和Cx43KD+hemin组加入终浓度为25 μmol/L hemin的无血清DMEM。对于Verteporfin(Vp，YAP抑制剂)干预实验分组：Cx43NC+hemin组、Cx43KD+hemin组和Cx43KD+hemin+Vp处理组。Vp的终浓度为5 μmol/L。

1.2.4 ROS,GSH,MDA测定和LDH释放实验检测铁死亡 上述各组接受处理12 h后的ASC，吸出培养液，加入终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA荧光探针，37 ℃孵育20 min后去除DCFH-DA，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。消化收集细胞，采用荧光酶标仪检测各孔荧光强度。以对照组为参照，计算各组细胞的相对ROS产生量。

收集上述各组接受处理12 h后的ASC，裂解细胞并提取蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，取细胞裂解蛋白样品，参照试剂盒说明书进行MDA和GSH检测，参照标准曲线计算出单位蛋白含量中MDA和GSH的含量，并以对照组为参照，计算各处理组细胞的相对MDA和GSH含量。

收集上述各组接受处理24 h后的ASC，参照LDH检测试剂盒说明书进行检测。按照以下公式计算细胞死亡率。细胞死亡率(%)=(处理组样品光密度-无细胞空白培养液对照组光密度)/(细胞最大酶活性的光密度-无细胞空白培养液对照组光密度)×100。

1.2.5 Tunel染色检测细胞凋亡 收集上述处理过12 h的细胞，PBS洗涤3次，加入4%多聚甲醛溶液固定1 h。使用一步法Tunel染色试剂盒检测细胞凋亡，参照试剂盒说明书进行Tunel染色，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.6 蛋白质印迹检测细胞凋亡和铁死亡相关蛋白表达 收集上述处理过的细胞，采用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，按照每泳道30 μg上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，依次孵育抗体后加入超敏ECL，在凝胶成像系统中观察结果并拍照，并用ImageJ进行灰度分析。使用的一抗和二抗稀释度：α微管蛋白(1 ∶1 000)，Cx43(1 ∶1 000)，Bax(1 ∶1 000)，Bcl2(1 ∶1 000)，GPX4(1 ∶1 000)，Caspase3(1 ∶1 000)，c-Caspase3(1 ∶1 000)；HPR标记的羊抗兔二抗(1 ∶5 000)。

1.2.7 免疫荧光染色检测YAP表达 将ASC以每孔5×104的密度接种于24孔板。按照上述加入处理因素后，将细胞用4%多聚甲醛固定1 h。PBS洗涤3次，室温下加入0.3% Triton X-100破膜15 min后加入10% BSA溶液封闭1 h。随后加入兔抗YAP抗体(1 ∶250)并于4 ℃孵育过夜。PBS洗涤后，加入驴抗兔IgG(1 ∶300)，室温孵育1 h。PBS洗涤后，DAPI染色5 min。激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.2.8 生物信息学分析

1.2.8.1 采用生物信息学对Cx43相关性差异基因进行分析 为了预测Cx43在脑组织中的功能，提取了GTEx数据库正常脑组织转录组数据，根据Cx43表达量对转录组表达矩阵进行分组，利用R语言pheatmap包绘制热图，当两组样本有截然不同的基因表达特征时，利用R语言limma包进行差异基因分析，Log2(差异倍数)的绝对值大于均值+2倍标准差且标准化P值小于0.05被认为是显著差异基因，基于此得出Cx43相关性差异基因以及其在不同分组中表达差异倍数，用R语言ggplot()函数绘制火山图。

1.2.8.2 采用生物信息学对Cx43相关性差异基因集富集分析 利用上述方法得到的差异表达基因及其表达变化倍数，使用R语言GSEABase包中的GSEA()函数，选择“h.all.v7.2.symbols.gmt”作为注释基因集、设定置换次数为1 000次进行基因集富集分析。结果中NES绝对值>1、NomP<0.05且FDRP<0.25被认为差异有统计学意义。最后选择显著富集到的GO基因集，包括Hippo通路基因集，铁离子通道结合基因集，脂质过氧化基因集，缺氧应激基因集等，利用GSEAplot()函数绘制富集图。

1.2.8.3 采用生物信息学构建转录调控网络并分析转录因子 转录调控网络(transcriptional regulatory network,TRN)由转录因子与其靶基因组成，转录因子识别特定DNA序列并在基因组层面上调控基因表达。基于此，提取GTEx数据库中1 141个正常脑组织转录组数据，通过sample()函数随机抽取100个转录组矩阵，将其作为标准矩阵，使用R语言RTN包tni.constructor()算法构建转录增强相关结构域(transcriptional enhanced associate domain，TEAD)转录因子家族的转录调控网络；然后利用Cx43表达量作为分组条件对这1 141个正常脑组织转录组表达数据进行分组，使用上述步骤构建好的转录调控网络，利用tni2tna.preprocess()进行转录因子调控网络富集分析，并利用tna.plot.gsea2()函数绘制富集图。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ASC中Cx43敲降效果的验证

Cx43NC和Cx43-shRNA1慢病毒MOI=60时感染效率最高，Cx43-shRNA2和Cx43-shRNA3慢病毒MOI=100时感染效率最高。蛋白质印迹检测不同慢病毒感染后ASC中Cx43表达水平，结果显示Cx43-shRNA1的敲降效率最佳(P<0.01)。见图1。因此选择Cx43NC(MOI=60)和Cx43-shRNA1(MOI=60)慢病毒进行后续实验。

A：不同MOI下病毒感染效率(标尺为100 μm)；B：不同干扰慢病毒的敲降效率验证。①: Control； ②: NC； ③: shRNA1； ④: shRNA2； ⑤: shRNA3

2.2 敲降ASC中Cx43表达后，hemin诱导的细胞凋亡减少，铁死亡增加

与对照组相比，hemin处理ASC引起细胞凋亡和铁死亡比例显著增加(P<0.01)，细胞凋亡相关指标Bax/Bcl-2和c-Caspase3/Caspase3显著升高(P<0.01)，铁死亡负相关指标GPX4和GSH含量显著降低(P<0.01)；与hemin处理组和Cx43NC+hemin组相比，Cx43KD+hemin组凋亡细胞比例显著降低(P<0.05)，细胞凋亡相关指标Bax/Bcl-2，c-Caspase3/Caspase3和铁死亡负相关指标GPX4和GSH表达量显著降低(P<0.01和P<0.05)，铁死亡正相关指标ROS和MDA的产生显著增加(P<0.05)，细胞铁死亡比例显著升高(P<0.05)。见图2。说明敲降ASC中Cx43表达后，细胞对hemin诱导的凋亡具有抵抗作用，而对铁死亡更敏感。

A： 蛋白印迹检测细胞凋亡和铁死亡相关蛋白表达及灰度分析； B： Tunel染色结果及凋亡细胞百分比(标尺为100 μm)； C： LDH释放实验测得细胞铁死亡率及铁死亡相关指标检测结果。①： Control； ②： Vehicle； ③： hemin； ④： Cx43NC+hemin； ⑤： Cx43KD+hemin

2.3 生信分析提示Cx43通过TEAD3调控铁死亡

热图所示GTEx正常人脑组织转录组数据库中，Cx43高/低表达的样本拥有截然不同的基因特征(图3A)，因此，利用此分组信息进行差异基因表达分析，发现有677个基因表达上调，872个基因表达下调(图3B)；利用差异表达基因的倍数变化信息，并使用基因注释基因集对其进行基因集富集分析(图3C)，得出Cx43与Hippo信号通路、铁离子结合基因集、脂质过氧化通路、缺氧应激等通路显著相关，提示Cx43可能参与调控脂质代谢以及铁死亡。进一步利用R语言RTN包进行转录因子调控网络分析(图3D、3E)，得出TEAD转录因子家族中TEAD3富集结果具有统计学意义，提示TEAD3可能参与调控Cx43相关性下游信号转导通路。

2.4 ASC中Cx43敲降引起YAP核转位

对照组中YAP基本均表达于胞质内，hemin处理组少部分细胞出现YAP核转位，在Cx43KD组中可见大量的细胞存在YAP核转位现象(图4中白色箭头)。提示敲降ASC中Cx43会抑制Hippo信号通路，触发YAP核转位。

2.5 Verteporfin处理逆转Cx43敲降引起的细胞凋亡抵抗和铁死亡增敏

与Cx43KD+hemin处理组相比，Cx43KD+hemin+Vp处理组细胞凋亡率增高而细胞铁死亡率降低(图5)，提示Cx43敲降对细胞凋亡和铁死亡的影响被部分逆转。

A： GTEx正常人脑组织转录组数据库中Cx43表达热图； B： Cx43高/低表达组差异基因表达分析火山图； C： 基因集富集分析； D～E： 转录因子调控网络分析

①: Control； ②: Vehicle； ③: hemin； ④: Cx43NC+hemin； ⑤: Cx43KD+hemin。标尺为75 μm

A： Tunel染色结果及凋亡细胞百分比； B： LDH释放实验测得细胞铁死亡率。①: Cx43NC+hemin； ②: Cx43KD+hemin； ③: Cx43KD+hemin+Vp

3 讨论

ASC是中枢神经系统内最重要且数量最庞大的支持细胞。ASC之间通过Cx43介导的细胞间缝隙连接形成离子和代谢物偶联，对于维持组织细胞稳态具有重要作用[16-19]。研究表明，ASC在遭受创伤、炎症、肿瘤等情况下发生活化，伴随着Cx43表达水平及其通道功能改变。

前期研究发现，Cx43介导的通道功能对于细胞凋亡和铁死亡具有重要影响：脑出血背景下Cx43 GJIC功能下降，Cx43半通道出现异常开放。维持Cx43 GJIC功能有助于缓解细胞外微环境中Fe2+负荷，并通过健康细胞向受损细胞输送GSH以及代谢底物等帮助受损细胞免于铁死亡及凋亡。ASC在遭受hemin引起的氧化应激损伤后，半通道异常开放会导致细胞膜通透性增加，细胞内的ATP外溢以及细胞外Ca2+内流，激活一系列炎症反应并引起细胞凋亡，阻断半通道有助于保护细胞免于凋亡(数据未在本文中显示)。

由于Cx43具有GJIC和半通道功能以及非通道相关的基因表达调控等多种功能，Cx43 GJIC和半通道在脑出血后继发损伤中具有截然不同的作用，为了探讨Cx43的基因表达调控功能在脑出血后继发性损伤中的作用及机制，本研究采用干扰慢病毒敲降ASC中Cx43表达，从而观察ASC对hemin诱导的凋亡和铁死亡的反应。结果显示敲减ASC中Cx43表达后，细胞对hemin诱导的细胞凋亡抵抗能力增强，而铁死亡敏感性增高。然而，Yu等[22]在顺铂诱导的急性肾损伤模型中发现，敲降Cx43表达可以抑制肾小管上皮细胞凋亡和铁死亡，但具体机制不明。这与本研究关于敲降Cx43对细胞铁死亡的影响存在分歧，可能是由于所研究的组织细胞类型以及Cx43基础表达水平差异有关。

为了研究Cx43与铁死亡的相关性及Cx43调控铁死亡的分子机制，本研究进行了GSEA分析，结果显示Cx43与铁代谢、脂氧合酶以及Hippo信号通路密切相关，并且极有可能通过Hippo通路中的TEAD3调控细胞铁死亡。Hippo通路是感知细胞外基质硬度和介导细胞接触抑制的重要信号通路，参与调控组织器官发育。YAP是Hippo通路的关键效应分子，Hippo通路的失活使原本被磷酸化而锚定于胞质中的YAP得以释放从而进入细胞核，与核内的TEAD结合形成转录复合体，调控间充质表型转化、细胞增殖及抗凋亡相关基因的表达[23]。本研究通过YAP免疫荧光染色对生信分析结果进行验证，结果发现敲降ASC中Cx43表达后出现YAP核转位，且采用YAP抑制剂可以逆转Cx43敲降对细胞凋亡和铁死亡的影响。证实了Cx43可以通过Hippo通路调控细胞凋亡和铁死亡。

在本课题组前期研究中发现，Cx43与YAP存在共定位，Cx43敲降可以触发YAP核转位，与TEAD结合启动ASC间充质表型转化[20]。本研究利用Tunel染色发现敲降Cx43表达的ASC表现出对hemin诱导的细胞凋亡的抵抗效应。然而通过检测细胞坏死及GPX4含量发现，敲降Cx43的表达增加了ASC对hemin诱导的铁死亡的敏感性。在肿瘤领域，大量研究表明间充质表型转化的肿瘤细胞增殖、迁移及抗凋亡能力增强。但最新研究表明，间充质表型的肿瘤细胞反而对铁死亡的耐受性降低，可能与Hippo通路调控NADH氧化酶NOX以及脂氧合酶LOX表达促进细胞膜脂质过氧化损伤有关[15,24-26]。本研究发现敲降ASC中Cx43表达后细胞对hemin诱导的铁死亡敏感性增加。基于前期Cx43敲降触发了YAP核转位的研究发现，结合本研究中的生信分析，提示Cx43敲降极有可能通过抑制Hippo通路，促进YAP核转位，与TEAD3结合形成转录复合体，调控细胞表型转化、抗凋亡和调控LOX、NOX等促铁死亡基因的表达而实现。本研究为后续进一步探讨Cx43调控细胞凋亡和铁死亡的机制提供了重要线索。