日本血吸虫源多肽SJMHE1通过调节脾脏IFN-γ和IL-10的分泌抑制小鼠自身免疫性甲状腺炎

张珊， 毛朝明， 董利阳， 刘佳梦， 郑婷婷， 高学荣， 徐小卫， 罗鑫凯， 汪雪峰

(江苏大学附属医院核医学科，江苏 镇江 212001)

自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是一类以桥本甲状腺炎为代表的内分泌系统常见病，是临床上最常见的自身免疫性疾病(约占30%)[1-2]。全球AIT的患病率为1%～2%，我国AIT患病率超过10%，并呈现逐年上升态势[3]。AIT的主要病理特征是甲状腺组织内大量淋巴细胞浸润(以Th1为主)、甲状腺滤泡结构破坏和甲状腺自身抗体如甲状腺球蛋白抗体(TgAb)产生[4-5]。AIT是导致甲状腺功能减退的主要疾病，临床目前仍无有效干预手段[6]。

大量研究证实，蠕虫感染对自身免疫性疾病存在抑制作用，据此而衍生的虫源产品成为当前治疗自身免疫性疾病的候选药库[7]。本课题组前期研究发现，日本血吸虫源多肽SJMHE1可显著改善小鼠急慢性结肠炎和胶原诱导的关节炎[8-9]，展现出潜在的自身免疫性疾病的治疗功效。本研究旨在探究SJMHE1对AIT小鼠的作用并初步揭示其作用机制，为AIT的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雌性C57BL/6小鼠25只，6～8周龄，体重(18±2)g，购自扬州大学比较医学中心。所有动物在12/12 h光暗循环和40%～60%相对湿度环境下饲养，并在实验前对环境条件进行3～4 d的适应。本研究依照江苏大学动物保护和使用委员会指南协议进行。

1.2 主要试剂

猪甲状腺球蛋白(porcine thyroglobulin,pTg)，弗氏完全佐剂(complete Freund′s adjuvant,CFA)以及弗氏不完全佐剂(incomplete Freund′s adjuvant,IFA)均购自美国Sigma公司；日本血吸虫源多肽SJMHE1由Top-peptide(中国上海)合成和纯化；逆转录试剂盒购自美国Genecopoeia公司；荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；流式细胞仪购自美国BD公司；ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 建立小鼠AIT模型 将15只小鼠随机分为对照组、AIT组、AIT+SJMHE1组，每组5只。为诱导小鼠AIT，将100 μg pTg乳化于等量的CFA中，并于第0天皮下注射于小鼠体内(对照组除外)。初次免疫2周后，给予该批小鼠相同剂量的pTg，并以1 ∶1的比例乳化于IFA中。为诱导AIT，小鼠全程用500 mg/L高碘水喂养。在造模前第7天，造模0、14 d给AIT-SJMHE1组小鼠皮下注射10 μg SJMHE1(与IFA制成100 μL乳化剂)。于第28天安乐死所有小鼠，采集血样和甲状腺组织样本，用于后续检测。

1.3.2 苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠甲状腺组织病理变化 每只小鼠使用5个不连续的冠状切片来观察甲状腺组织病理改变。安乐死小鼠后，沿颈部正中剪开皮肤，将肌肉分离以显露甲状腺。用眼科剪刀摘除腺体，并用4%甲醛固定，石蜡包埋，制备4 μm厚的切片，随后进行HE染色。甲状腺炎症评分基于甲状腺浸润的百分比，0分：没有浸润；1分：1个或2个卵泡周围有炎性细胞的积聚；2分：存在达到卵泡大小的1个或2个炎性细胞灶；3分：10%～40%的炎性细胞浸润；4分：>40%的炎性细胞浸润。

1.3.3 化学发光法检测小鼠血清TgAb 将收集的小鼠血样室温放置30 min，待血样凝集后以1 000×g离心10 min以去除沉淀物，即刻检测，或者分装于-20 ℃以下冻存。采用全自动化学发光测定仪(Maglumi 4000 Plus)检测小鼠血清中TgAb的含量。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测小鼠甲状腺和脾脏中IFN-γ和IL-10mRNA表达 用RNAiso Plus(TaKaRa公司)提取甲状腺组织和脾脏RNA，用逆转录试剂盒逆转录1 μg的总RNA得到cDNA。按照制造商的说明，以β-肌动蛋白为内参，进行实时定量PCR分析。引物由美国Genecopoeia公司设计合成。引物序列分别如下：β-肌动蛋白上游引物为5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物为5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′；IFN-γ上游引物为5′-CGGGACACAATGAAGCCTA-3′，下游引物为5′-CTTGCTGATTATGCCATT-3′；IL-10上游引物为5′-GACCAG-CTGAAGTGACTA-3′，下游引物为5′-GATAAGGCTCAACCGTTA-3′。PCR反应体系组成如下：TB Green Premix ExTaqⅡ 10 μL、上下游引物各0.8 μL、DNA模板2 μL、灭菌水6.4 μL；两步法PCR扩增程序如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃退火5 s，60 ℃延伸20 s，40个循环；熔解曲线分析。

1.3.5 ELISA检测小鼠血清中IFN-γ和IL-10的含量 根据试剂盒说明书，采用ELISA试剂盒检测小鼠血清中细胞因子IFN-γ和IL-10的含量。检测样本避免反复冻融，在检测前将样本缓慢地恢复至室温，轻柔地混匀。

1.3.6 流式细胞术检测FITC-SJMHE1在小鼠甲状腺组织及脾脏的定位情况 另外选取10只未经过任何处理的雌性C57BL/6小鼠，随机分为实验组和对照组，每组5只。将荧光标记的多肽FITC-SJMHE1于皮下注射入实验组小鼠体内，对照组小鼠注射等量PBS。3 d后安乐死小鼠，并收集小鼠甲状腺和脾脏于冰上研磨；吸取研磨液至离心管，1 500 r/min离心5 min；弃上清液，加红细胞裂解液2 mL，混匀，静置2 min；离心去上清液，并用1 mL缓冲液重悬；用牛鲍计数板于镜下计数，吸取105个细胞至含300 μL缓冲液的流式管中，用100 μL多聚甲醛固定后，用流式细胞分析仪检测FITC-SJMHE1在甲状腺和脾脏中的表达。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 SJMHE1对AIT小鼠甲状腺组织学及血清TgAb水平的影响

与对照组相比，AIT小鼠甲状腺滤泡大小不均、结构破坏明显且周边有大量炎症细胞浸润；与AIT组相比，SJMHE1减轻了AIT小鼠甲状腺滤泡的破坏及滤泡间淋巴细胞的浸润。甲状腺组织炎症评分显示3组小鼠间差异有统计学意义(F=30.73，P<0.01)，AIT组小鼠甲状腺组织炎症评分较对照组显著上升(P<0.01)，而SJMHE1的处理则显著下调了AIT组小鼠的炎症评分(P<0.01)。化学发光结果显示，AIT组小鼠血清TgAb水平明显高于对照组，SJMHE1则显著降低了AIT小鼠血清TgAb水平(P<0.01)。见图1。

A：甲状腺组织病理变化(HE染色,×400)；B：甲状腺组织病理炎症评分；C：血清TgAb水平

2.2 SJMHE1对AIT小鼠甲状腺组织中IFN-γ和IL-10 mRNA表达的调节

与对照组相比，AIT组小鼠甲状腺组织IFN-γ和IL-10mRNA的表达明显升高(P均<0.01)；与AIT组相比，AIT+SJMHE1组IFN-γmRNA的表达明显降低(P<0.05)，而IL-10mRNA的表达明显升高(P<0.05)。见图2。

图2 SJMHE1降低AIT小鼠甲状腺组织中

2.3 SJMHE1对AIT小鼠脾脏组织中IFN-γ和IL-10 mRNA表达量的调节

与对照组相比，AIT组小鼠脾脏中IFN-γmRNA表达明显升高(P<0.01)，而IL-10mRNA表达无显著差异(P>0.05)；与AIT组相比，SJMHE1处理显著降低AIT小鼠脾脏中IFN-γmRNA表达，而上调IL-10mRNA表达，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

图3 SJMHE1降低AIT小鼠脾脏中

2.4 SJMHE1对AIT小鼠血清中IFN-γ和IL-10含量的调节

与对照组相比，AIT组小鼠血清中IFN-γ和IL-10含量均显著升高(P均<0.01)。与AIT组相比，SJMHE1干预后小鼠血清中IFN-γ含量显著下降(P<0.01)，而IL-10含量显著升高(P<0.05)。见图4。

图4 SJMHE1降低AIT小鼠血清中IFN-γ并上调IL-10含量

2.5 SJMHE1在小鼠甲状腺及脾脏中的分布

给予小鼠FITC-SJMHE1注射后，流式细胞术检测结果显示，FITC荧光标记的SJMHE1存在于小鼠脾脏组织，而甲状腺组织未检测到相应荧光标记蛋白。见图5。

图5 FITC-SJMHE1在小鼠甲状腺及脾脏中的分布

3 讨论

逐年上升的患病率以及由此导致的甲状腺功能破坏使得探寻AIT的新型防治策略成为研究热点。“卫生假说”指出，一些感染性病原体，特别是蠕虫，有能力影响宿主的免疫系统，它们在感染宿主的同时亦可预防宿主自身免疫性疾病的发生，从而改善对炎症反应的调节。这种抑制炎症的能力既符合宿主的利益，也符合寄生虫的利益，是数百万年共同进化的结果[10]。基于此观点，“蠕虫疗法”被广泛用于一些自身免疫性疾病的防治，例如口服猪鞭虫可缓解炎性肠病患者的病情[11]。本研究发现，日本血吸虫源多肽SJMHE1在AIT小鼠发病中发挥干预作用，SJMHE1可显著减轻AIT小鼠甲状腺炎症反应并降低血清中自身抗体TgAb的水平，这在进一步补充“蠕虫产品”的同时亦为AIT的防治提供了新策略。

AIT是由免疫紊乱而引发的器官特异性自身免疫性疾病，也是甲状腺最常见的病理状态，多种细胞因子在其发病中扮演重要角色[12-13]。Th1细胞释放的促炎因子如IFN-γ会促进甲状腺细胞的凋亡、抑制甲状腺激素的合成进而引发甲状腺功能障碍[14-15]。IL-10是一种经典的具有抗炎特性的细胞因子，可抑制宿主针对病原体产生过度的免疫反应，减轻炎症引发的组织破坏，从而在包括AIT在内的自身免疫性疾病中发挥抑制自身免疫反应的重要作用[16-18]。本研究结果表明，SJMHE1可显著降低AIT小鼠甲状腺组织中IFN-γmRNA的表达，而上调IL-10mRNA的表达，这从分子层面提示SJMHE1可通过调节IFN-γ和IL-10来抑制免疫炎症反应，从而对AIT发挥一定的预防和治疗作用。

本课题组前期研究发现，SJMHE1不仅可调节过敏性哮喘小鼠肺组织中促炎和抗炎细胞因子的表达，亦对脾脏中促炎及抗炎细胞因子有平衡作用[19-20]。本研究发现SJMHE1可下调AIT小鼠甲状腺和脾脏组织中IFN-γmRNA的表达，且上调IL-10mRNA的表达，提示SJMHE1对局部或(和)全身免疫应答有着调节作用。在此基础上，本研究进一步通过流式技术分析了FITC-SJMHE1在小鼠体内的分布，发现SJMHE1并不能到达小鼠甲状腺组织，然而可以到达脾脏组织，这一结果推测SJMHE1对AIT的干预并非通过对甲状腺组织的直接作用，而是借由固有免疫器官脾脏的免疫调节来发挥功能。此外，ELISA检测结果表明SJMHE1可下调AIT小鼠血清中IFN-γ而上调IL-10的含量。综上结果提示，SJMHE1可能通过对脾脏IFN-γ及IL-10的调节来缓解AIT小鼠甲状腺病理损伤。然而，SJMHE1调节IFN-γ及IL-10的具体作用机制仍需在今后的研究中进一步阐明。