484例疑似ABO新生儿溶血病患儿的血清学实验结果及相关影响因素分析

陈文雅(通信作者)，王明泉，高晶晶

泉州市第一医院输血科 (福建泉州 362000)

新生儿溶血病(hemolytic disease of the newborn，HDN)特指由于母婴之间的血型不合所引发的胎儿或新生儿红细胞遭受破坏的一种免疫性溶血性疾病[1]，其主要临床症状及体征为不同程度的黄疸、水肿、贫血、肝脾肿大，严重者可继发胆红素脑病，即核黄疸。核黄疸的病死率达70%，即便患儿存活下来，也会遗留运动障碍、智力不全等后遗症[2]。在过去几十年中，得益于抗-D免疫球蛋白在RhD新生儿溶血病(RhD-HDN)免疫预防中的成功应用，因RhD引发的妊娠期异体免疫发生率得到大幅度下降，HDN的模式也发生了转变，ABO血型系统不合及其他非D型同种异型抗体已成为许多发达国家发生HDN的最主要原因[3]。中国作为发展中国家，以ABO血型系统不合(约占85.3%)最为常见，其次为Rh血型系统不合(约占14.6%)[4]。众所周知，ABO新生儿溶血病(ABO-HDN)的临床症状较轻，绝大多数患儿仅表现为黄疸，少数患儿可出现贫血、水肿等症状[5]；但也有文献[6-7]报道过因ABO-HDN引发较为严重的溶血病病例，部分患儿需采取换血治疗，这也提醒我们，ABO-HDN并不总是轻症，也需临床多给予关注与重视。本研究通过分析我院收治的484例疑似ABO-HDN患儿的血型血清学实验结果及临床病历资料，旨在了解ABO-HDN的发生分布情况，探讨该病的相关影响因素，以期为ABO-HDN的早期诊断提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2021年11月在我院顺利分娩的484对符合条件的母婴为研究对象。母亲年龄17～46岁，平均(30.04±4.60)岁；患儿进行溶血三项检测时的日龄为10 h至36 d，平均(4.91±4.85)d；出生体质量1 800～4 250 g，平均(3 190.46±438.49)g；其中，男患儿246例，女患儿238例。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

纳入标准：母婴ABO血型不合；母婴RhD均为阳性；母亲血型不规则抗体筛查结果呈阴性；母婴双方病历资料均完整；单胎妊娠。排除标准：孕妇既往有输血史；孕妇有自身免疫性溶血性疾病或其他溶血性疾病；新生儿患有除ABO-HDN之外的其他溶血性疾病。

1.2 仪器与试剂

所使用的仪器与试剂包括全自动血型/配血系统分析仪、卡式离心机、ABO-Rh血型检测卡、抗人球蛋白检测卡、人ABO血型反定型用红细胞测定试剂盒、红细胞血型抗体筛选细胞，均由Diagnostic Grifols,S.A.配套提供；FYQ型试剂卡孵育器由长春博研科学仪器有限责任公司提供，Baso微电脑控制血库专用离心机由台湾贝索生物技术有限公司提供，酸放散试剂盒由长春博迅生物技术有限责任公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1血型与不规则抗体筛查的检测

ABO血型、Rh(D)血型及血型不规则抗体筛查均由Diana全自动血型/配血系统分析仪进行全自动化检测。

1.3.2溶血三项检测

(1)直接抗人球蛋白试验：向抗人球蛋白检测卡反应孔内加入50 μl患儿的红细胞悬液(浓度为1%)，离心(1 100 r/min)处理9 min后判读结果。(2)游离抗体试验：向已标记好的抗人球蛋白检测卡各反应孔内加入50 μl血型抗体筛选红细胞试剂、ABO血型反定型用红细胞试剂，再向各反应孔内加入25 μl患儿血清，以37 ℃孵育15 min，离心(1 100 r/min)处理9 min后判读结果。(3)抗体放散试验：使用0.9%氯化钠注射液洗涤患儿红细胞3遍，最后1遍的洗涤液留取作为对照；严格按照酸放散试剂盒的使用说明书操作制备放散液，向已标记好的抗人球蛋白检测卡各反应孔内加入50 μl血型抗体筛选红细胞试剂、ABO血型反定型用红细胞试剂，再向各反应孔内加入25 μl上述制备好的放散液和对照液，以37 ℃孵育15 min，最后离心(1 100 r/min)处理9 min后判读结果。

1.4 ABO-HDN诊断标准[8]

(1)母婴之间存在ABO血型不合。(2)抗体放散试验为诊断ABO-HDN的金标准，只要抗体放散试验为阳性，即可诊断为ABO-HDN；抗体放散试验为阴性，而直接抗人球蛋白试验和(或)游离抗体试验为阳性，则为可疑ABO-HDN；三项检测结果均为阴性，则不可诊断为ABO-HDN。

1.5 统计学处理

使用Excel 2016建立数据库，使用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，样本率间的比较采用χ2检验，单向有序R×2表资料的研究目的若为分析样本率与等级分层变量之间是否存在线性变化趋势，则采用线性趋势卡方检验；多因素分析采用Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 484份溶血三项检测结果

484份疑似ABO-HDN患儿的标本，共检测出阳性标本321份，其中，305例被确诊为ABO-HDN，其余16例被判定为可疑ABO-HDN；321份阳性标本中，主要检出组合为三项试验均阳性、游离抗体试验和抗体放散试验双阳性及抗体放散试验单阳性，占87.54%(281/321)；305例确诊患儿中，直接抗人球蛋白试验检出127例(占41.64%)，游离抗体试验检出218例(占71.48%)，抗体放散试验检出305例(占100%)，见表1。

表1 484份溶血三项检测结果分布情况

2.2 不同母婴ABO血型不合组合的ABO-HDN阳性率情况

母亲为O型的患儿(O-A、O-B)ABO-HDN阳性率为72.88%(301/413)，母亲为非O型的患儿(A-AB、A-B、B-A、B-AB)ABO-HDN阳性率为5.63%(4/71),差异有统计学意义(χ2=117.558，P<0.05)；母亲为O型、患儿为A型或B型的ABO-HDN阳性率分别为59.88%、81.27%，差异有统计学意义(χ2=22.809，P<0.05)，见表2。

表2 不同母婴ABO血型不合组合的ABO-HDN发生分布情况

2.3 送检日龄对ABO-HDN检出率的影响

不同送检日龄的ABO-HDN检出率不完全相同(χ2=61.343，P<0.05)；而且，经线性趋势卡方检验显示，随着送检日龄的推迟，ABO-HDN检出率呈线性下降趋势(χ2=59.249，P<0.05)，见表3。

表3 不同送检日龄分组的ABO-HDN检出分布情况

2.4 患儿发生ABO-HDN的单因素分析

经单因素分析显示，ABO-HDN的发生可能受母亲妊娠次数、患儿性别及出生体质量的影响(P<0.05)；不受母亲年龄的影响(P>0.05)，见表4。

表4 患儿发生ABO-HDN的单因素分析[例(%)]

2.5 患儿发生ABO-HDN的多因素分析

以单因素分析中具有统计学意义的影响因素为自变量进行赋值(见表5)，通过二项Logistic回归分析显示，母亲妊娠次数≥2次、女患儿、出生体质量≥3 000 g是ABO-HDN发生的独立危险因素(P<0.05)，见表6。

表5 自变量赋值情况

表6 患儿发生ABO-HDN的多因素分析

3 讨论

ABO-HDN的发生源于胎儿从父方遗传到母方所缺乏的A型或B型抗原，导致母婴ABO血型不合，一旦胎儿的红细胞通过胎盘进入到母体中，即有可能对母体形成免疫刺激，产生相应的IgG抗体；IgG抗体作为唯一能通过胎盘的抗体类型，再借助胎盘反向进入胎儿体内，致敏胎儿红细胞，并激活单核-巨噬细胞系统，释放大量溶酶体酶，破坏胎儿红细胞，最后造成溶血[9]。ABO-HDN在胎儿时期溶血所产生的多余胆红素可经胎盘由母体代为清除，出生后溶血仍在继续，但新生儿相对不成熟的肝脏系统无法清除过量的胆红素，因而造成新生儿高胆红素血症，而皮肤黄染等征象一般于新生儿出生后2～3 d才逐渐显现[10-11]。鉴于ABO-HDN的临床表现相对滞后于其真实病情，为了避免因延迟诊断和治疗给患儿健康造成损害，提升ABO-HDN的早期诊断能力尤为重要。

溶血三项检测是目前国内诊断ABO-HDN最主要的血清学实验。本研究结果显示，溶血三项检测结果显示，484例疑似ABO-HDN患儿中，305例被确诊为ABO-HDN，确诊率达63.02%(305/484)，与尹明伟等[12]报道的69.97%确诊率相近。主要阳性检出模式集中分布于三项试验均阳型、游离抗体试验和抗体放散试验双阳性及抗体放散试验单阳性这三种组合，占87.54%。在305例确诊病例中，直接抗人球蛋白试验检出127例(占41.64%)，游离抗体试验检出218例(占71.48%)，抗体放散试验检出305例(占100%)。可见，抗体放散试验的灵敏度最高，直接抗人球蛋白试验的灵敏度最低。直接抗人球蛋白试验与抗体放散试验均为检测患儿红细胞是否被IgG抗体致敏的试验，但由于在新生儿时期，机体ABO抗原表达量仅为成人的25%～50%，导致可结合于患儿红细胞上的IgG抗体相对有限，因此易造成直接抗人球蛋白试验出现假阴性的结果[13]；抗体放散试验则相当于直接抗人球蛋白试验的放大试验，利用比直接抗人球蛋白试验多出几百倍红细胞的量，通过酸放散等方法将致敏于红细胞上的IgG抗体洗脱下来，因而获得含有高滴度IgG抗体的放散液，从而提升了试验的灵敏度[14]。当然，有关ABO-HDN的诊断不能单纯依靠溶血三项检测，还需完善其他相关辅助性检查，并结合患儿临床表现进行综合分析。有文献指出[15]，网织红计数、脐带血总胆素或早期总胆红素(产后第6小时)及产前母体IgG抗-A(B)滴度等有助于ABO-HDN的早期诊断。由于本研究为回顾性调查，在资料收集上有一定的局限性，故可出现部分检查缺失、检测时间不统一或检测方法不一致等情况，导致未能综合分析其他辅助检查与溶血三项检测相结合对ABO-HDN早期诊断的临床应用价值。

通过对母亲是否为O型的患儿进行分组比较后我们发现，母亲为O型的ABO-HDN阳性率高达72.88%，母亲为非O型的ABO-HDN阳性率仅为5.63%，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果说明，ABO-HDN高发于O型产妇所分娩的非O型新生儿；母婴血型为O-A、O-B的患儿ABO-HDN阳性率分别为59.88%、81.27%，显然，B型患儿的阳性率高于A型患儿，差异有统计学意义(P<0.05)，该结果与Bel Hadj等[16]和陈陆飞等[17]的研究结果相一致，但与杨爱月等[18]和李彦美等[19]的研究结果不一致。有关A型、B型患儿ABO-HDN阳性率的比较，不同的研究得出的结果截然不同，笔者分析其原因可能与不同地区ABO血型的分布存在差异有关。

本研究结果显示，当送检日龄为0～2 d时，ABO-HDN检出率高达82.66%；但随着送检日龄的推迟，ABO-HDN检出率呈逐步下降的趋势。这主要考虑随着产妇病情进展，被致敏患儿的红细胞不断被机体识别破坏，游离于血浆中的IgG抗体也不断被机体中的血型抗原物质所中和消耗，从而导致检出率逐步下降[20]。这也提示我们，应尽快对可疑ABO-HDN患儿进行溶血三项检测，以免因假阴性结果而延误治疗；同时我们发现，当送检日龄≥7 d时，仍有32.39%的检出率，提示日龄超7 d的患儿依然有进行检测的意义，但也需警惕，其存在假阴性率较高的风险。需要注意的是，送检日龄在一定程度上也受临床医师对疾病风险评估的影响，越是早期送检，面临的临床预估风险往往越大，这也可能是早期送检检出率偏高的原因之一。基于日龄对ABO-HDN检出率的影响，笔者提议，留取新生儿脐带血样本进行血型鉴定和溶血三项检测等检测，不仅有助于ABO-HDN的早期诊断，而且可减少有创操作对患儿造成的损伤。早在2015年，意大利1份有关预防和治疗HDN的建议书中就曾提出，对所有新生儿脐带血样本进行直接抗人球蛋白试验检测，若试验呈阳性，再进行抗体放散试验检测[21]。结合我国国情，对所有新生儿进行普遍筛查显然是不切实际的，但可通过制定ABO-HDN风险评估标准，针对达到中高风险的新生儿进行常规筛查。

两项Logistic回归分析显示，母亲妊娠次数≥2次、女患儿、出生体质量≥3 000 g是ABO-HDN发生的独立危险因素(P<0.05)。由于自然界广泛存在与A、B型抗原相类似的物质(如植物、寄生虫、细菌、伤寒疫苗、破伤风及白喉类毒素等)，若母亲在首次妊娠前接触到这类物质，即有可能免疫刺激母体，产生IgG抗-A(B)抗体，因此，ABO-HDN可发生于第一胎[22]，且伴随着母亲妊娠次数的增加，胎儿红细胞再次进入母体的概率也随之增加；与初次免疫应答不同的是，再次免疫应答只要接触到小剂量的抗原，便可快速产生大量且持续时间较长的IgG抗体，诱发ABO-HDN发生，因此，妊娠史可增加ABO-HDN的发生风险[23]。有关出生体质量对ABO-HDN发生的影响，考虑可能为出生体质量≥3 000 g的患儿ABO血型抗原发育相对于出生体质量<3 000 g的患儿成熟，这更有利于IgG抗-A(B)抗体致敏于红细胞上，故而增加了发病风险[24]；至于女患儿更易发生ABO-HDN，考虑其原因可能与患儿雌激素水平有关；据文献报道[25]，雌激素有增强免疫反应的作用。

综上所述，溶血三项检测对ABO-HDN的诊断具有重要价值；其中，抗体放散试验具有高灵敏度的特征。鉴于送检日龄对ABO-HDN检出率的影响，针对可疑ABO-HDN的患儿，应尽早进行溶血三项检测，以免因漏诊而延误治疗；同时，笔者也提倡，应合理完善产前关于ABO-HDN的辅助性检查，如夫妇血型鉴定、母体IgG抗-A(B)滴度及IgG亚型测定、母体外周血游离胎儿DNA(cff-DNA)血型基因检测、胎儿大脑中动脉峰值流速(MCA-PSV)多普勒检测等，综合考量产前检测及相关危险因素的影响，制定ABO-HDN风险评估标准[26, 27]。对达到中高风险的新生儿，应留取脐带血样进行血型鉴定、溶血三项检测、网织红计数和总胆红素测定，以实现早诊断早治疗，保障患儿生命健康。