恶性肺结节中自噬蛋白Beclin1和LC3的表达变化及临床意义

沈 乐，陈娅楠，耑 冰

《2020年全球癌症统计报告》显示，肺癌的全球发病率位居第二位，全球约有180万肺癌死亡病例[1]，且中国肺癌发病率高于全球其他国家[2]。随着人们健康意识的增强，医疗水平不断提升，肺结节的检出率明显增高[3]。恶性肺结节为早期肺癌，病理诊断主要为I期。自噬现象是细胞内噬菌体降解细胞内折叠错误、老化蛋白质及其自身受损细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的代谢通路[4]。Beclin1蛋白主要诱导并启动自噬过程，在自噬的溶酶体降解过程中起抑癌作用[5]。LC3蛋白是自噬特异的标记物，可促进自噬小体成熟，其表达能反映细胞自噬过程中的活性。本研究通过检测Beclin1和LC3在恶性肺结节中的表达，探讨Beclin1和LC3在恶性肺结节中的表达变化及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料:选取2019年3月至2020年12月宁夏回族自治区人民医院胸外科手术切除的恶性肺结节组织标本40例，其中男性16例，女性24例，平均年龄(63.3±11.2)岁。病理类型分别为鳞癌4例、腺癌36例。同期手术切除癌旁组织30例(距肺癌边缘3～5 cm)以及良性肺结节组织标本18例作为对照组，所有患者均经过病理学检查确诊。本研究经宁夏回族自治区人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂L：兔抗人Beclin1、LC3多克隆抗体和通用型免疫组化试检测剂盒均来自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化SP法:按SP法进行免疫组化染色，实验组织标本用4%甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，5 μm厚切片，具体操作严格按照试剂盒说明进行。用已知Beclin1、LC3阳性的组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定:结果判定采用双盲法，由两位高年资病理科医师观察每张切片，在每张切片中随机选择5个高倍视野，其中每个视野观察100个细胞。依据染色强度与阳性细胞比率分别进行评估，最终得到综合评定。染色强度评分，无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞比率评分，阳性细胞占总细胞数的比率<10%为0分，11%～50%为1分，51%～80%为2分，>80%为3分。综合评分[6]=染色强度评分×阳性细胞比率评分：0分为阴性(-)，1～4分为阳性(+/++)，>4分为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法:采用SPSS 26.0统计软件，自噬蛋白在良恶性肺结节及癌旁组织中的表达采用多组独立样本Kruskal-Wallis H秩和检验，与恶性肺结节临床病理因素之间用相关性检验，自噬蛋白之间的相关性用Spearman等级相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自噬蛋白Beclin1和LC3在恶性肺结节的表达免疫组化结果:显微镜下观察肺组织细胞内出现棕黄色颗粒为阳性表达。所有切片均在同一放大倍数、同一光强度下分析。免疫组化结果显示，自噬蛋白Beclin1和LC3阳性表达主要分布在肺泡上皮细胞，定位于细胞核，呈棕黄色颗粒状，强阳性者细胞质内也有着色，见图1至图2(目录后)。

2.2 自噬蛋白Beclin1和LC3在良恶性肺结节及癌旁组织中的表达:Beclin1在恶性肺结节、良性肺结节及癌旁组织中的阳性表达率分别为30.00%、43.33%、100.00%，LC3在恶性肺结节、良性肺结节及癌旁组织中的阳性表达率分别为27.50%、53.33%、100.00%。恶性肺结节中Beclin1和LC3的阳性表达率均低于良性肺结节和癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 Beclin1、LC3在良恶性肺结节及癌旁组织中的表达

2.3 自噬蛋白Beclin1和LC3的表达与恶性肺结节临床病理因素的关系:Beclin1和LC3自噬蛋白的表达与恶性肺结节患者年龄的相关性具有统计学意义(P<0.05)，与性别、病理类型、TNM分期的相关性差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 40例恶性肺结节患者Beclin1、LC3蛋白表达与临床病理因素的关系

2.4 自噬蛋白Beclin1和LC3的相关性:Beclin1和LC3在恶性肺结节中的表达呈正相关性，差异有统计学意义(r=0.452，P<0.05)，见表3。

表3 Beclin1与LC3在恶性肺结节中表达的相关性

3 讨论

自噬是真核细胞的再循环过程，通过在细胞内降解衰老或破损细胞器、合成或折叠错误及老化的蛋白质，从而实现细胞的代谢需求和细胞器的更新，在维持细胞内环境的稳定性和蛋白代谢平衡中发挥着关键的功能[7-8]。自噬活性如长期受到抑制，可使得细胞内的危害因素不断积聚，其功能的降低会提高细胞的氧化应激，加速致瘤性突变，导致肿瘤的发生发展，同时自噬随着肿瘤恶性程度的增加而上调[9]。在肿瘤发展的早期，如阻碍自噬作用可导致癌前病变的发展，进而促进肿瘤的形成[10]。肺结节是一种病因不明的多系统多脏器的肉芽肿性病变，通常侵犯肺、双侧肺门淋巴结等器官，包括良性结节(非癌性)及恶性(癌性)结节，而恶性肺结节通常指肺内恶性肿瘤，即早期肺癌，所以恶性肺结节的早发现及早治疗对提高肺癌患者生存率和预后的改善至关重要[11]。Beclin1是哺乳动物细胞中唯一的特异性自噬基因，其位于人类染色体17q21上，作为启动自噬的启动因子，通过介导其他自噬蛋白定位于吞噬泡，在自噬发生与成熟的过程中具有重大作用。有研究表明，Beclin1基因缺失及蛋白表达降低会引起恶性肿瘤的发生，卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中，Beclin1基因表达明显降低，并且低于其相应正常组织[12]。本研究结果显示，Beclin1在恶性肺结节中的阳性表达率低于癌旁组织和良性肺结节，提示恶性肺结节中存在Beclin1蛋白表达下调，使得自噬活性下降，导致异常细胞持续增加，最终形成恶性肺结节。

本研究中，Beclin1和LC3的表达与患者年龄相关，与王文涛等[13]研究结果一致。LC3是Beclin1蛋白调控下游的关键基因，其表达水平与自噬活性密切相关，是检测细胞自噬活性的特异性标志物[14]。研究表明，LC3的异常表达与胃癌、肺癌、肝癌等的发生发展有关[15]。本研究结果显示,恶性肺结节中LC3蛋白低表达，表达水平低于癌旁组织和良性肺结节，提示在恶性肺结节发生发展过程中，LC3表达缺失或下调降低了细胞自噬活性，增加了肿瘤易感性，促进了恶性肺结节的发展。

自噬可促进细胞稳态平衡、分化、发育和生存，是一种与维持细胞组织稳态性相关的高度选择性细胞清除途径，即高度保守的生物学过程。对比相关研究患者年龄普遍偏高，本研究也以60岁以上患者居多，这可能与自噬活性改变有关。相关研究表明，随着年龄的增长，自噬相关蛋白的活性也随之降低，加速细胞损伤并促进衰老相关疾病的发展[16]。

本研究结果表明，恶性肺结节中自噬蛋白Beclin1和LC3的阳性表达呈正相关性，与张秀义等[4]研究一致。Beclin1和LC3作为细胞自噬调节通路的上下游靶点，二者低表达可使得细胞自噬活性降低，阻碍细胞内环境稳定，导致恶性肺结节的发生，结果提示Beclin1和LC3蛋白联合检测对恶性肺结节治疗及预后具有一定参考价值。

综上所述，自噬蛋白Beclin1和LC3在恶性肺结节中低表达，细胞自噬活性的降低对恶性肺结节的发生发展具有一定作用。