红景天苷保护脱矿牙本质基质的实验研究①

李双鹏，刘陆滨，范采萧

(佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002)

中药提取出一种苯乙醇类化合物，将其命名为红景天苷，与药物作用密切相关[1]。MMP-2 的表达与肿瘤转移及侵袭程度密切相关，是肿瘤恶性进展的标志[2，3]。本研究进一步发现红景天苷在肺纤维化过程中使MMP-2及TIMP1mRNA的表达和蛋白的合成受到抑制，红景天苷能够抑制MMP-2、TIMP-2mRNA和蛋白的表达，恢复二者的平衡从而延缓甚至抑制纤维化的进程，保护中毒大鼠的肺组织[4]。在临床实验研究中已经证实适宜浓度的红景天苷能够抑制MMP-1的表达[5]，因此，提出关于红景天苷能通过调节牙源性MMPs活性的表达从而抑制牙本质胶原纤维降解和牙本质脱矿假设，来探究红景天苷对脱矿牙本质的影响，这对防治牙齿龋坏有着重要的意义。同时也有学者发现红景天苷对人重组的MMPs有抑制作用。但红景天苷是否对牙本质中由于酸蚀活化的基质金属蛋白酶有抑制作用尚无报道。本研究旨在探讨红景天苷对牙本质中活化MMPs的影响，拟为红景天苷应用于临床提高黏接效果提供理论依据。报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

红景天苷(98%)，0.2%氯己定，去离子水，新鲜无龋磨牙，MMP-2活性比色法定量检测试剂盒，磷酸，耐水砂纸，36%乙酸，磷酸二氢钾，慢速切割机，液氮罐，高速涡轮机，台式离心机，酶标仪，恒温箱，激光共聚焦显微镜，试管，滤纸，罗丹明。

1.2 实验溶液及样品的制备

1.2.1实验溶液的配置

配置红景天苷溶液：用去离子水配置10mmol/L红景天苷母液，放于4℃冰箱中储存，避光备用。在实验中，使用去离子水稀释母液，配置浓度分别为10、20、60、100、200、400μmmol/L的酸性脱矿液：使用去离子水，将36%乙酸和磷酸二氢钾混合成液体，其中乙酸的所含浓度为50μmmol/L，磷酸二氢钾的所含浓度为1.5μmmol/L，酸性脱矿液的pH值为4.5。配置中性缓冲液：将去离子水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和磷酸二氢钾混合配置成液体，其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸所含浓度为20μmmol/L，磷酸二氢钾的所含浓度为1.5μmmol/L，中性缓冲液的pH值为7.0。

1.2.2 牙本质片的制备

选取离体牙10颗，皆来自2020-09～2020-10佳木斯大学第二附属医院就诊患者。所有标本都是没有龋坏的磨牙，患者因智齿周炎而需要拔除。获取标本后仔细清理，将所附着的牙周软组织去除，同时要清理色素及牙结石，完成后清洗干净备用。准备冰箱，设置为-80℃，将制备好的标本置于其中保存。将新鲜离体牙的牙根部用面团期的自凝树脂包埋，不包埋牙冠部分，造成与慢速切割机卡槽一样的样本，4℃生理盐水事先准备，将处理好的离体牙立即置于其中，进行冷却处理，然后放入慢速切割机的卡槽中，开启慢速切割机，对牙齿进行切割。方向与牙体长轴垂直，整个过程必须要在流水持续冷却下完成，最终形成30片(200±20)μm牙本质薄片。启动高速旋轮机，磨除牙釉质及浅层牙本质，该过程要沿着釉牙本质界面进行。生理盐水事先准备完成，将磨好的切片置于其中， -20℃冷冻备用。

1.2.3 实验分组

实验组：红景天苷，浓度梯度分别为10、20、60、100、200、400μmmol/L；阳性对照组：0.2%氯己定；阴性对照组：去离子水。

1.3 实验方法

1.3.1 基质金属蛋白酶的提取

将制备的(200±20)μm厚的30个牙本质片放在冻存管中，冷冻在液氮罐里6h，将冷冻的牙本质片取出后用研钵快速研磨呈粉末状。从粉末中用电子秤称量出重量为1g的牙本质粉，并将其放入到试管中。将5mL的10%的磷酸溶液加入到试管中，并在4℃冰箱冷藏的环境中脱矿6h。4℃台式离心机准备完成，将上述样品置于其中进行离心，3000r/min,2min，分层后去上清。准备100mmol/L Tris-Hcl液体，将其加入到上述试管当中，共需要5mL，再次进行离心处理，时间与上述相同，去上清。该过程反复进行，共需要3次，完成后洗涤。准备十二烷基硫酸钠，将其加入到试管当中，共需要5mL，进行离心处理，4℃12000r/min,20min，去上清，所余为脱矿牙本质中的MMPs。

1.3.2 基质金属蛋白酶抑制率

对提取物进行测试，确定其中的酶活性。依体液MMP-2活性比色法定量检测试剂盒指示，测定提取液中的酶活性大小。从96孔板中选取5个实验待测孔，并标记好分组，移取84μL缓冲液，10μL反应液和1μL底物液到相对应的5个实验孔中。恒温箱准备完成，温度设置为37℃，将孔板置于其中进行孵育，共用时3min，再分别加入30μL待测样品，在405mm波长下，用酶标仪中进行实验，同时计时，选取不同时间点的读数，分别为第0、15min，记录最终的结果。在此基础上计算提取物酶活性，整个过程要按照试剂盒说明书完成。

各实验分组酶活性检测：准备缓冲液，将其移入到96孔板当中，共需要84μL，该过程严格按照检测试剂盒说明书完成，同时还需要加入反应液，共10μL，另外再加1μL底物液，再取MMPs提取液，加入30μL，上述所有物质都加入到阴性对照组当中。另外在阳性对照组和实验组中加入84μL缓冲液，其余物质也与之前相同，然后分别移取10μL去离子水，10μL的0.2%氯己定，以及不同浓度红景天苷各10μL，将其加入到实验组，阴性对照组，阳性对照组中，每组实验反复重复5次，立即放入到酶标仪中读数，酶标仪波长为405nm,然后将96孔板放进37℃恒温箱里，15min后将96孔板放入酶标仪中测定吸光度读数。记录第0、15min结果，按照试剂盒公式[(完全活性读数-空背景对照读数)-(抑制剂样品活性读数-样本背景读数)]/(完全活性读数-空背景对照读数)=实际抑制百分率，进行计算提取物酶活性抑制率。

1.3.3 牙本质试件脱矿程度

将已处理完成的15个牙本质块备用，将其等分为3组。去离子水，红景天苷，氯己定每组分别5个样本。各组溶液准备完成，将分组后的试件放入其中，进行pH循环处理。不同组的处理液有所不同，可将相应的牙本质块放置其中处置10min，(阴性对照组：去离子水组；阳性对照组:0.2%氯己定；实验组：红景天苷400μmol/L)中处置10min，取出后进行冲洗，需要使用去离子水，共用时1min，再用滤潮纸吸干牙本质试件上的水分，然后将其放入装有5mL酸性脱矿液的试管中进行脱矿1h，然后用去离子水冲洗1min，再用滤潮纸吸干牙本质试件上的水分，将其放入装有5mL中性缓冲液的试管中，缓冲液的pH为7.0，pH循环，一日二次，共10d。酸性脱矿液和中性缓冲液需要放至于恒温摇床中，37℃条件下慢速进行，不做pH循环时，可准备中性缓冲液，将上述试件置于其中，于37℃恒温箱中放置，中性缓冲液和处理液需要定时更换，一般间隔时间不超过24h，需要遵循现配现用的原则。使用激光共聚焦显微镜在529nm下观察各个牙本质试件的形状和染色深度，计算出每组牙本质试件的平均脱矿深度。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 红景天苷对基质金属蛋白酶活性的抑制率

见表1。

表1 各组样品对基质金属蛋白酶酶活性抑制率

2.2 红景天苷对脱矿牙本质的影响

激光共聚焦显微镜3D图像1.400μmol/L红景天苷的染色宽度深度低于去离子水组，各组样本脱矿深度见表2。红景天苷脱矿深度与阴性对照组对比有统计学意义(P<0.05)，但与阳性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组样本脱矿深度

3 讨论

龋病是一种常见的牙齿疾病，多种因素可以导致其发生，细菌相对常见，它可以对底物进行分解，导致酸性物质生成，从而使局部pH值下降，使得牙本质龋坏部位病变进一步加重。由于局部呈现酸性，可以溶解羟基磷灰石，导致胶原纤维暴露。当龋坏部位的pH处于2.5～3时，MMPs前体发生变化，由失活状态转变为活化状态，唾液本身可以起到一定的稀释作用，因此可以调节局部的酸碱度变化，使其由酸性变成中性，于是激活的基质金属蛋白酶就水解了牙本质有机质。实验中所用的pH循环模型已被众多实验[6～8]所证实。本研究需要确定不同浓度红景天苷对MMP-2的抑制作用，整个过程需要使用酶标仪完成，结果显示400μmol/L时结果与阳性对照组相当，因此将该浓度红景天苷组作为实验组，确定其耐脱矿能力， 0.2%氯己定为阳性对照组，阴性对照组是去离子水组。使用罗丹明B染料染色后，酸性脱矿液使牙本质脱矿，罗丹明B依靠其强大的渗透能力，渗入各个孔隙中。这也说明了脱矿程度越深，染色条带越宽。从染色条带对比情况来看，颜色较浅的是红景天干和阳性对照组，并且整体相对较窄，颜色较深的为阴性对照组，宽度相对较宽一些。提示400μmol/L红景天苷对于牙本质脱矿具有影响，可以有效抑制其过程。对各试件荧光强度进行观察，该过程需要使用激光共聚焦显微镜[9]，根据结果确定牙本质脱矿程度，具有操作简捷、反应快等特点，扫描后可以得到清楚的三维图像，能够更直观的了解牙本质脱矿程度。从最终的脱矿程度对比情况来看，400μmol/L红景天苷组相对较小，与阴性对照组有所差异，由此可见其能够有效抑制牙本质脱矿，使最终的深度有所变浅，宽度变窄。