华蟾酥毒基对神经胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭及凋亡的影响*

吴 青，鲁菲菲，邓志鹏，李忻蔚，杨易倩，梅文球，胡美纯，林 莉**

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院医学部基础医学院)

神经胶质瘤是常见的原发性中枢神经系统肿瘤，多形性胶质母细胞瘤(GBM,WHO IV级)是其中最常见、最具侵袭性和致命性的颅内恶性肿瘤，近几年国内外的发病率逐年上升[1-2]。因其恶性程度较高，患者存活期短，临床治疗效果差，预后不佳[3]。以手术辅以放疗和化疗是当前GBM的主要治疗手段，但具有侵袭性、预后差和分化不良等弱点，因此，寻找新的治疗方案是目前研究的重点[4]。在肿瘤治疗方面，天然小分子化合物有分子量小、亲脂性高、易透过血脑屏障等特点，已成为近几年的研究热点。华蟾酥毒基(cinobufagin)是从中药蟾酥中提取的具有抗癌活性的蟾毒配基之一，是蟾酥和蟾皮的主要活性成分，具有强心、抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种药理活性[5-6]。本研究旨在阐明华蟾酥毒基治疗GBM的疗效并探讨其作用机制，为华蟾酥毒基应用于临床提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人胶质母细胞瘤U251细胞株为本实验室保存；华蟾酥毒基(CAS号：470-37-1)购自于上海源叶公司；DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶均购自于美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Hoechst细胞凋亡检测试剂盒均购自于碧云天公司；Matrigel胶购自于美国Corning公司；抗体GAPDH、Bcl-2、Bax、P53均购自于ABclonal公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

U251细胞培养于5%CO2、37℃恒温培养箱。培养基为含10%FBS和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM，待细胞长至90%时进行传代，并在细胞处于对数生长期时进行实验。所有细胞学实验均重复3次及以上。

1.2.2 细胞增殖实验

U251细胞接种于96孔板，每孔细胞数密度5×103个/mL，置于培养箱培养24h，给予不同浓度(0、0.25、0.5、1、2.5、5 μmol/L)的华蟾酥毒基，放入培养箱继续培养24、48、72h后加入MTT，继续培养4h，加入DMSO置于摇床上室温混匀，使用酶标仪490nm的吸光度(OD)进行检测，用GraphPad Prism 8软件绘制细胞生存曲线并计算IC50值。

1.2.3 克隆形成实验

将U251细胞按1×103个/孔密度接种于6孔板中，次日给予不同浓度的华蟾酥毒基，放置培养箱培养7～14d，待观察到细胞克隆形成时终止培养，用PBS清洗后，每孔加入4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，流水冲洗多余染色液，待6孔板干燥后拍照并统计结果。

1.2.4 细胞横向迁移实验

取对数生长期U251细胞，以2.0×105个/孔接种于6孔板，放置培养箱培养，待细胞密度长至90%左右时，开始划痕，用PBS润洗并去除脱落细胞后，加入不同浓度含药培养基继续培养24h，并在0、24h时拍摄细胞生长状态和划痕处变化。

1.2.5 细胞侵袭和迁移实验

取对数生长期U251细胞，用无血清培养基培养8h后，以1.0×105个/孔接种于上室，上室铺Matrigel胶，下室分别加入含不同浓度华蟾酥毒基的10% FBS培养基，24h后终止培养，取出小室，吸弃培养基，用棉签轻轻擦去Matrigel胶和未穿膜的表面细胞，4%多聚甲醛固定小室里的细胞后，结晶紫染色，干燥后显微镜下拍照并统计结果。

1.2.6 细胞凋亡检测实验

取对数生长期U251细胞，以2.0×105个/孔接种在24孔板中，当细胞密度长至90%左右时，加入不同浓度含药培养基，继续培养。24h后，避光条件下吸弃旧培养基，PBS清洗后加入Hoechst33342染色液，室温避光反应15～30min，PBS缓慢清洗3遍后，于荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.7 Western blot实验

收集对数生长期U251细胞，使用不同浓度(0、0.5、1、2μmol/L)华蟾酥毒基处理24h后，消化并收集不同加药浓度的细胞，冰上裂解后低温离心，BCA法蛋白定量测定、Western blot等多个常规实验步骤，以GAPDH为内参计算目的蛋白的相对表达量，每组实验重复3次及以上。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 华蟾酥毒基抑制U251细胞增殖

MTT实验结果显示(图1)，与对照组相比，给药24h后，经不同浓度华蟾酥毒基处理后的U251细胞活力均受到不同程度的抑制，细胞的增殖能力随华蟾酥毒基药物浓度的增加而降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 华蟾酥毒基对U251细胞增殖能力的影响(n=3，标尺：100μm，*P<0.05)

2.2 华蟾酥毒基抑制U251细胞克隆形成

克隆形成实验表明，与对照组相比，随着华蟾酥毒基剂量的增加，U251细胞集落形成显著减少(图2)，说明华蟾酥毒基对U251细胞的克隆形成具有显著抑制作用(*P<0.05)。

图2 华蟾酥毒基对U251细胞克隆形成能力的影响(n=3,*P<0.05)

2.3 华蟾酥毒基抑制U251细胞横向迁移

划痕实验结果显示，经0、0.5、1和2μmol/L华蟾酥毒基处理24h后，U251细胞的迁移能力明显低于空白对照组，且呈剂量依赖性(图3)，经不同浓度华蟾酥毒基处理后的U251细胞，与对照组相比，划痕距离随药物浓度的增加逐渐增宽，实验组细胞迁移率的下降程度均具有显著性差异(P<0.05)。

图3 华蟾酥毒基对U251细胞横向迁移能力的影响(n=3,标尺：200μm，*P<0.05)

2.4 华蟾酥毒基抑制U251细胞的纵向迁移和侵袭

Transwell侵袭实验结果显示(图4a)，与对照组比较，作用24h后，U251细胞随华蟾酥毒基给药浓度的增加，其细胞迁移数量减少，且呈浓度依赖性改变。与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。

Transwell迁移结果显示(图4b)，与对照组相比，华蟾酥毒基作用U251细胞24h后，随着浓度的增加，其细胞迁移数量逐渐减少，呈浓度依赖性改变，与对照组比较，有统计学意义(P<0.05)。

图4 华蟾酥毒基对U251细胞纵向迁移(图a)及侵袭(图b)能力的影响(n=3,标尺：100μm，*P<0.05)

2.5 华蟾酥毒基诱导U251细胞凋亡

采用Hoechst33342染色法检测华蟾酥毒基对U251细胞凋亡的影响。结果如图5所示，与对照组相比，给药组活细胞数量减少、细胞核变小、染色质固缩并出现边缘化及细胞核发生形态学改变，且随给药浓度的增加，正常U251细胞数量逐渐减少。上述结果表明，华蟾酥毒基可诱导U251细胞凋亡。

图5 华蟾酥毒基诱导U251细胞发生凋亡(n=3,标尺：100μm，*P<0.05)

2.6 Western blot实验检测肿瘤细胞Bax、Bcl-2蛋白表达

Western blot结果及统计分析如图6所示，不同浓度华蟾酥毒基作用U251细胞24h后,与对照组比较,凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调，且呈剂量依赖性降低；Bax蛋白表达与华蟾酥毒基浓度相关并呈上调趋势，2μmol/L华蟾酥毒基实验组与对照组相比，具有显著性差异(P<0.05)。

图6 华蟾酥毒基对U251细胞蛋白表达的影响(n=3,标尺：100μm，*P<0.05)

3 讨 论

GBM是一种极具侵袭性和致命性的原发性颅内恶性肿瘤，恶性程度高，预后差和死亡率高，手术和化疗都不能彻底治疗该疾病[7]。天然小分子化合物不仅来源广、种类多、易获得、结构可控，而且可以高效、可逆和准确地诱导细胞分化，因此，寻找新型天然小分子化合物靶向治疗GBM尤为重要。本研究通过体外实验，初步证实华蟾酥毒基可有效抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，提示华蟾酥毒基可作为治疗GBM的潜在药物。

华蟾酥毒基是一种源于蟾蜍中蟾毒内酯、多肽和生物碱的主要活性化合物，是中药蟾酥及蟾皮起活性作用的主要成分。以往研究发现[8-9]，华蟾酥毒基在肿瘤治疗中具有靶向作用，在体外也具有抗肿瘤作用。本研究发现，华蟾酥毒基可呈浓度依赖性抑制U251细胞活力及细胞迁移能力。由此提示，华蟾酥毒基对胶质瘤细胞具有显著的抑制作用。

肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡平衡失调的结果，细胞凋亡在肿瘤的发生、发展中主要起负调控作用。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡机制中起核心作用，可促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2之间相互拮抗，二者形成异源二聚体共同作用参与肿瘤细胞的凋亡过程[10]。本研究发现，华蟾酥毒基作用于U251细胞后，细胞中Bcl-2蛋白表达下调、Bax蛋白表达上调。因此推测，华蟾酥毒基可能通过调节以上两种凋亡蛋白的表达促进U251细胞凋亡。

综上所述，华蟾酥毒基可抑制胶质瘤细胞U251的生长、迁移及侵袭，且通过调节Bcl-2蛋白表达降低以及Bax蛋白表达升高来诱导凋亡，从而为华蟾酥毒基作为潜在的治疗GBM提供一定的实验依据。