酪蛋白结构特性及应用研究进展

刘晶晶，张薇，吴锦涛，刘洋，肖静

（齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东 济南 250353）

酪蛋白（casein，CN）又称干酪素、酪朊和乳酪素，是一类磷钙结合型蛋白，对酸性环境敏感，在pH4.7左右时会发生聚沉，在母牛、羊、骆驼及人乳中约占总乳成分的2.75%，是哺乳动物乳中含量最高、营养功能最强的蛋白质。酪蛋白分子结构极其复杂，目前为止还没有一个比较确定的分子式，其分子质量大约在20 kDa～25 kDa，根据分子特性的不同可分为四类，分别为αs1-CN、αs2-CN、β-CN和k-CN。酪蛋白能够被蛋白酶分解为多种小分子生物活性肽，具有抗癌、抗微生物、抗高血压、抗氧化、降低胆固醇、肠道调节和免疫调节等功能[1]。本文综述了酪蛋白的结构特性、来源含量及应用领域，以期为酪蛋白在各行业中的研究和广泛应用提供参考。

1 酪蛋白来源及含量

酪蛋白是哺乳动物乳中最主要的蛋白质，目前所用酪蛋白主要来源于一些较为常见且产量高、成本低的乳产品，如牛奶、羊奶等。在其他哺乳动物乳如牦牛、骆驼及马乳中，酪蛋白的含量也非常丰富，但价格较高。不同品种的乳中4种酪蛋白单体的比例也不相同。人乳中没有α-CN，主要为β-CN，约占总酪蛋白含量的70%，还有小部分的k-CN，婴幼儿主要通过人乳中的酪蛋白来获取氨基酸和部分钙、磷，同时酪蛋白在胃中会形成凝乳，凝乳更易于被婴幼儿消化吸收[2-3]。酪蛋白主要来源及各单体含量见表1，4种酪蛋白单体分子量见表2。

表2 4种酪蛋白单体分子量Table 2 Molecular weight of four casein monomers

2 酪蛋白结构

酪蛋白的4种亚基形式为αs1-CN、αs2-CN、β-CN和k-CN，这4种单体又以α-螺旋、β-折叠、β-转角等形式组成了酪蛋白的空间结构[4]。

2.1 酪蛋白空间结构差异

不同品种乳中酪蛋白的结构有所差异，李萌等[5]通过圆二色谱和红外光谱相结合的方法研究发现，对于婴幼儿来说，羊奶β-CN比牛奶β-CN更易消化和吸收，主要原因为二者之间结构上的差异。通过圆二色谱测得羊乳β-CN和牛乳β-CN的三级结构形式主要为无规则卷曲，羊乳β-CN的无规则卷曲含量明显高于牛乳β-CN，而α-螺旋和β-折叠含量均明显低于牛乳β-CN，β-转角含量则无明显差异。红外光谱测得两者三级结构中羊乳β-CN的α-螺旋、β-折叠及β-转角含量分别比牛乳β-CN低18%～20%、9%～10%、0.6%～1.0%，而无规卷曲含量比牛乳β-酪蛋白高17%～19%。利用分光光度法分析得出，位于羊乳β-CN和牛乳β-CN表面的巯基含量差异不明显，但羊乳β-CN的总巯基含量明显低于牛乳β-CN，羊乳β-CN和牛乳β-CN在接近等电点（pH4～5）时，溶解性降低，远离等电点时溶解性升高。在pH2～4和pH6～10时，羊乳β-CN溶解性高于牛乳β-CN，而在等电点时羊乳β-CN溶解性低于牛乳β-CN，羊乳β-CN分子与分子间的相互作用力更强，分子表面包含了更多的疏水基团。

β-CN是人乳酪蛋白中最主要的酪蛋白成分，与牛乳β-CN相比，人乳β-CN三级结构更加疏松，内部包裹的巯基数量更少，导致胶束内部三级结构更为松散[1，5]。

2.2 酪蛋白胶束结构

酪蛋白以胶束的方式悬浮于水体系中，酪蛋白胶束由约20 000个酪蛋白分子组合而成，其结构与普遍具有亲水性头部和疏水性尾部的胶束不同。矿物质因子、αs-CN和β-CN共同构成了酪蛋白胶束的内部结构，而k-CN覆盖于酪蛋白胶束的表层，是酪蛋白胶束维持稳定的重要因素之一。酪蛋白胶束的内部含有大量水分子，每克蛋白平均要结合3 g～4 g水，这对于酪蛋白胶束内部结构来说是一个非常重要的特征。扫描电镜观察表明[4]，酪蛋白胶束的外部形状结构呈粗糙的球形，但酪蛋白胶束内部结构无法确定。目前研究者认为酪蛋白胶束的结构模型共有4个，分别为核-壳模型、双结合模型、亚基模型和Holt结构模型（又叫纳米簇模型）。目前，人们普遍认可的是Holt模型，该模型认为酪蛋白胶束的内部是由磷酸钙与酪蛋白分子连接缠绕在一起而组成的微簇复合物，k-CN如同毛刷样覆盖于酪蛋白胶束的外层以维持其稳定性。Holt模型综合了上述各个模型的合理点，并且是通过小角X射线衍射测定及各种不同验证性试验后获得[6]，因此是目前最为合理的结构模型。

2.3 酪蛋白胶束稳定性

2.3.1 k-CN对酪蛋白胶束稳定性的影响

酪蛋白胶束的稳定性由酪蛋白胶束结构决定，k-CN在酪蛋白胶束的稳定性中起着关键作用。k-CN位于酪蛋白胶束的外层，具有两性性质，其疏水的尾部吸附于酪蛋白胶束内部的其他蛋白分子上，而头部向外突出形成亲水壳，使酪蛋白胶束之间相互排斥。k-CN能够使脯氨酸含量较高的酪蛋白依然呈现出动态的球状模式。k-CN与αs1-CN和β-CN的不同之处在于，k-CN和αs2-CN都含有2个半胱氨酸残基。因此，k-CN能够在酪蛋白胶束表面之间形成二硫键多聚体，使胶束结构保持稳定[4，7]。

2.3.2 酸碱度对酪蛋白胶束的影响

不同环境因素对酪蛋白胶束的稳定性也具有十分重要的影响，其中最主要的因素之一是pH值。研究人员在研究pH2～12时酪蛋白胶束的变化时发现[7-8]，当pH值在2～3及6～12时，酪蛋白分子开始自发结合形成胶束，当pH值在3～5.5时，酪蛋白分子开始产生聚沉，此时为酪蛋白等电点。静电相互作用、氢键及疏水相互作用对酪蛋白胶束构成具有重要作用，在较低pH值（2.0～3.0）时酪蛋白胶束结构更为紧密，而在pH5.5～12条件下，酪蛋白胶束结构松弛，且胶束的半径随pH值的升高而增加。前者主要原因是疏水相互作用和氢键使酪蛋白胶束维持稳定，而后者是因为带负电荷的酪蛋白分子互相排斥导致胶束结构松弛。

2.3.3 高温对酪蛋白胶束结构稳定性的影响

高温会对酪蛋白颗粒间的氢离子和体系内的盐离子产生影响，能够使酪蛋白二级结构中α-螺旋的含量大大降低，而α-螺旋是蛋白质中最稳固的结构，因此高温会对酪蛋白的稳定性产生重要的影响[9-10]。

2.3.4 超高压处理对酪蛋白稳定性的影响

超高压处理是指在100 MPa以上的压力下处理食物样品。采用超高压处理能够破坏酪蛋白的非共价键，当在100 MPa～200 MPa处理时蛋白质会发生可逆的变性，当压力在300 MPa以上时会使蛋白质三级结构和四级结构的氢键产生不可逆的变性。超高压会影响酪蛋白的结构和功能从而改变其稳定性[11]。Huppertz等[12]研究表明，酪蛋白在100 MPa～200 MPa的压力下，其胶束无明显变化，在250 MPa下处理15 min以后，酪蛋白的胶束团明显增大，在300 MPa～800 MPa下，酪蛋白的胶束结构部分分解，胶束团变小。

2.3.5 超声处理对酪蛋白胶束的影响

超声波是一种无法在真空中传播的机械波，其波长一般低于2 cm。经过超声处理的酪蛋白结构表面原本的致密状态变得松动并出现片层，使酪蛋白的结构松散。经超声处理后，酪蛋白胶束表面如毛刷状覆盖的k-CN片段会发生断裂，因此经超声处理后的酪蛋白胶团粒径减小。另外经试验证明，低频超声对酪蛋白胶束的破坏力要比高频超声大，被破坏的酪蛋白胶束之间结合成小的聚合体[13-15]。

3 酪蛋白的应用

3.1 酪蛋白在食品中的应用

3.1.1 生产婴幼儿乳粉

酪蛋白含有8种必需氨基酸，营养价值极高，不需要预先进行变性就能够被酪蛋白酶水解。将酪蛋白应用于婴幼儿配方乳粉、食品，其易被婴幼儿身体吸收，对于补充婴幼儿身体所需营养具有极重要的作用。由于β-CN是人母乳里最主要的蛋白质成分，近年来人们开始使用β-CN模拟婴幼儿配方乳粉的蛋白质组成，优化婴幼儿乳粉的蛋白质组成和氨基酸比例，提升婴幼儿配方乳粉的营养品质[16-17]。

3.1.2 生产营养补充剂

酪蛋白易与金属离子尤其是钙离子结合构成可溶性复合物，能够促使钙离子在无维生素D参与下被肠壁细胞所吸收，因此酪蛋白可用作补钙、铁营养的补充剂。对于爱好健身的人来说，酪蛋白既能供给人体正常运转所需要的蛋白质，又能够很好地保护肌肉不受损伤和抗蛋白质分解。此外酪蛋白还能够在人体的血液中保存较长的时间，因此，由酪蛋白制作的蛋白粉类营养补充剂深受广大健身爱好者的喜爱[18]。

3.1.3 肉类产品加工

酪蛋白具有较多的磷酸基团，具有吸湿性和持水性。在肉类产品中酪蛋白能够与肉中的蛋白质复合吸收水分，从而增加肉制品的持水性、黏着力，提升肉类产品品质。另外，由于酪蛋白拥有非常稳固的螯合系统，能够与其他多种物质相结合并赋予食品更好的质地和口味，因此人们开始利用酪蛋白与黄原胶经热处理后呈现的纤维样结构来模仿脂肪湿润嫩滑、乳膏状的口感，从而代替某些特定人群饮食中的肉类和脂类食品[19]。

3.1.4 用作食品添加剂

根据酪蛋白类型、螯合作用及较明显的亲水区和疏水区等，酪蛋白可作为良好的发泡剂和乳化剂，通过反应时间、水分、pH值、温度和催化剂的种类等变化可以得到各种不一样的风味食品，如冰淇淋、乳饮料、西式糕点、饼干、面包、肉制品及水产肉糜制品等，可用作食品添加剂[20-21]。

3.1.5 生产食品保鲜膜

食品在储存期间会发生颜色、气味、味道等方面的改变，氧气会对食品产生氧化降解作用导致食品变质。一般来说大部分的包装都是减少食品与氧气之间的接触，例如真空包装等，能够有效地减轻氧气引起的降解反应并延长保质期。近年来研究发现，基于涂膜保鲜技术制备的可食薄膜可以有效避免物质迁移、实现机械性质保护，并在不影响食品风味的前提下保持其原有成分。酪蛋白能够发生自我缔合或与其他物质发生缔合作用，形成稳定的网状聚合物结构，且酪蛋白在高温下较稳定，因此酪蛋白生成的薄膜性能极佳，对食品的保质期和风味有很好的保障作用[22-25]。

3.2 酪蛋白在医疗领域的应用

3.2.1 用于药物载体

酪蛋白的鳌合结构可以很好地与其他物质鳌合，促进被鳌合物质更好地吸收，并且能在特定靶向持续释放。酪蛋白胶束和纳米粒子已成功地应用于多种疏水生物分子的纳米包埋，如β-128胡萝卜素、维生素D2、氟他胺、姜黄素、槲皮素等，具有较好的溶解性和保质期[26-27]。Bindhya等[28]采用微波辅助法从大豆中提取出膳食异黄酮染料木素，并将药物包封于牛奶酪蛋白载体后与孕酮结合，靶向表达于乳腺癌或卵巢癌细胞上的受体，使得载体载药量优化至88.67%，提高了大豆提取物药物对卵巢癌和三阴性乳腺癌细胞的抗癌活性方面的潜力。

3.2.2 制备生物活性肽

酪蛋白在亲本蛋白质序列中是一种无活性的状态，利用蛋白水解酶水解掉酪蛋白特定肽键后，成为具有生物活性的多肽片段。这些活性肽多用作肽类药物或试剂，也可用于食品添加剂或功能性食品中，易被人体在小肠中吸收，具有极高的安全性，且酪蛋白资源丰富、价格便宜、易于工业化生产。因此，酪蛋白来源的生物活性肽越来越受到人们的重视[29]。目前，人们已发现了数十种具备生理性能的生物活性肽，如Mudgil等[30]使用碱性蛋白酶和链霉蛋白酶E处理牛和骆驼酪蛋白分别生成了牛乳和骆驼乳酪蛋白水解产物，用以模拟胃肠道消化后的有效水解物，发现两者对胰脂肪酶和胆固醇酯酶的抑制均有显著作用。抑制胰脂肪酶分泌是治疗肥胖的有效方法，因此，骆驼乳和牛乳中的酪蛋白水解物具有开发为新抗肥胖功能化合物的潜力。这些活性肽具有十分重要且普遍的生物学功能和调节功能，生物学和营养功能为其大规模的生产提供广阔的市场。对于大部分衍生自酪蛋白的生物活性肽，由于酪蛋白水解产物中活性肽的分离和纯化难度较大，并且检测方法和技术还尚未成熟，活性肽的生理机制暂不清楚，因此其工业化生产还存在一定困难[31-32]。

3.2.3 制备医用止血剂

出血是指严重创伤和创伤后受损血管的循环血量的丧失。理想的止血剂能迅速止血，不会引起任何不良反应。基于天然聚合物的纳米纤维材料具有很高的比表面积、较强的吸液能力、足够的机械稳定性，因此有利于开发为止血剂。酪蛋白是生产抗凝剂和血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin I-converting enzyme inhibitory，ACEI）的极好来源，酪蛋白水解物通过延长凝血酶时间（thrombin time，TT）和活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）而显示出强大的抗凝血活性，并具有较强的血管紧张素转换酶活性[33]。Tu等[34]首次提出了一种制备自组装纳米纤维壳聚糖-酪蛋白聚电解质复合物（polyelectrolyte complexes，PECs）新策略，利用聚合物之间的络合作用来制造直径非常小的纳米纤维。由于直径较小，壳聚糖-酪蛋白纳米纤维提供了非常大的表面积与血液成分相互作用，并表现出色的凝血效率。此外，壳聚糖-酪蛋白PECs具有良好的血液相容性、无毒。同时，酪蛋白还有助于上皮细胞增殖和恢复上皮屏障的完整性（上皮恢复），增强止血剂的伤口愈合活性。

3.3 酪蛋白在3D打印中的应用

表面活性生物聚合物的应用为3D可打印油墨提供了良好的机会和新的前景。理想的油墨必须表现出具有可恢复结构的假塑性、黏弹性和触变特性，以便以所需的印刷适性有效印刷[35]。Shahbazi等[36]将微晶纤维素通过一个简单、可持续的乙酰化方法疏水改性。然后，将功能化的微晶纤维素加入到酪蛋白基乳剂中，取代部分脂肪，形成的Pickering乳液具有理想的假塑性、黏弹性、液滴大小、触变特性和可逆的动态基质。因此，Pickering乳液形式的酪蛋白基油墨已显示出可用于3D打印的可持续打印油墨的潜力。

4 展望

酪蛋白可以作为钙、铁及蛋白质营养补充剂，能够与其他物质发生鳌合反应实现药物缓释，具有良好的发泡、黏连、乳化和成膜特性，酪蛋白来源的生物活性肽还可应用于自身免疫功能低下、移植排斥反应和肿瘤等的治疗，在食品和医疗等行业中的应用越来越普遍。但酪蛋白胶束的内部结构人们目前尚不能确定，不同品种乳中的酪蛋白胶束结构和组成也存在较大差异，因此，人们还需要对不同乳源的酪蛋白胶束进行内部结构、组成等方面的深入研究以及相应检测方法的改进和创新，以便探讨不同乳源酪蛋白胶束的形成机制和结构差异。