涤痰解毒方对急性有机磷农药中毒大鼠阿托品化后血清炎症因子水平和重要脏器超微结构的影响▲

刘 玲 邵 良 凌 峰 黄 磊 甘 露

(湖南中医药大学第三附属医院急危重症医学科，湖南省株洲市 412000)

有机磷农药中毒是我国农村最常见的农药中毒类型，其病情凶险，死亡率高[1]。急性有机磷农药中毒(acute organophosphorus pesticide poisoning，AOPP)患者经洗胃及静脉推注阿托品等急救处理后仍然存在极大的生命危险，常需转入重症监护室继续治疗。中医无AOPP病名，但存在与AOPP临床表现相似的中医症候群。在AOPP的急救治疗达到阿托品化且可进行后续治疗时，患者证型以痰湿内阻型最为常见，临床表现为呼吸气促、喉间少痰、汗出、腹胀、烦闷不安、头晕目眩、舌苔白腻等症状，查体肺部听诊有湿啰音。对于此证型，中医治疗采用解毒祛痰利湿法进行治疗，临床实践表明我科室自拟涤痰解毒方对改善此类患者的预后有较好效果。本研究从降低炎症因子，保护肺、大脑等重要脏器功能的角度，探讨涤痰解毒方治疗中期AOPP(即AOPP阿托品化后)的作用机制，为推广中医药在急危重症中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠18只，雄性，6周龄，180～200 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号：SCXK(湘)2019-0004)]，均给予常规饲料饲养，饲养环境温度为20 ℃～26 ℃，湿度为40%～70%。

1.2 药物 用生理盐水将77.5%的敌敌畏(山东大成生物化工有限公司，产品标准编号：GB 2548-2008)配置成浓度为0.65%敌敌畏溶液，按65 mg/kg的剂量造模。阿托品(安徽长江药业有限公司，批准文号：国家准字H34021900)，解磷定(成都力思特制药股份有限公司，CAS：19032801)，长托宁(成都力思特制药股份有限公司，批准文号：国家准字H20020606)。涤痰解毒方的组方包括陈皮15 g、半夏10 g、茯苓20 g、胆南星10 g、竹茹10 g、川芎15 g、枳实10 g、厚朴15 g、瓜蒌15 g、党参15 g、桔梗15 g、生甘草10 g；取5剂，由湖南中医药大学第三附属医院药剂科制剂室制备，水提醇沉法制备浓缩液，调整至相当于含生药材2 g/mL，将pH值调整至6.5～7.0，4 ℃保存。

1.3 主要试剂 苏木素染液(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9610)，伊红染色液、Scott蓝化液(Solarbio公司，批号：G1100、G1865)，超净高级封片胶(珠海贝索生物技术有限公司，批号：YZB)，大鼠白细胞介素(interleukin,IL)-1β检测试剂盒、IL-6检测试剂盒(江苏酶免实业有限公司，批号：MM-0047R1、MM-0190R1)。

1.4 主要仪器 WD-2012B型全自动酶标仪(北京六一生物科技有限公司)，BD/BC-415DKEM型冷藏冷冻箱(美的集团股份有限公司)，DHP-9054型电热恒温培养箱(山东博科生物产业有限公司)，BL-420S型生物机能实验系统(成都泰盟软件有限公司)，JEM-1230型透射电镜(80KV，JEOL Ltd.)。

1.5 实验方法

1.5.1 建立中期AOPP模型：采用随机数字表法将18只大鼠分成6组，即正常组、模型组、西药组、等剂量涤痰解毒方组、高剂量涤痰解毒方组、西药+等剂量涤痰解毒方组，每组3只。根据预实验的结果，除正常组外，其他组均按照65 mg/kg的剂量给予敌敌畏溶液灌胃(每100 g体重灌1 mL敌敌畏溶液)，然后观察大鼠的症状，大鼠一般在10 min内均会出现中毒症状，表现为全身震颤、四肢僵直、流涎、针尖样瞳孔，严重者会出现眼鼻出血症状。在老鼠四肢僵直无法挪步时，给予大鼠臀部肌内注射0.5 mg阿托品+3 mg解磷定解救，以后每隔15 min肌内注射0.5 mg阿托品+1.5 mg解磷定，直至阿托品化(瞳孔散大、心率加快等)[2]。

1.5.2 分组及给药：模型制备成功后，西药组大鼠给予0.1 mg/kg的长托宁臀部肌内注射，等剂量涤痰解毒方组、高剂量涤痰解毒方组大鼠分别按生药14 g/kg、28 g/kg体重的剂量给予涤痰解毒方灌胃，西药+等剂量涤痰解毒方组大鼠给予0.1 mg/kg的长托宁臀部肌内注射和14 g/kg涤痰解毒方灌胃。所有大鼠的中药灌胃2次/d，长托宁肌内注射2次/d。模型组按照每100 g体重1 mL给予温开水灌胃，2次/d。

1.5.3 观察指标：治疗24 h后处死所有大鼠，心脏采血10 mL，采用低温离心机以3 000 r/min离心10 min，常规分离血清，于-70 ℃冰箱内冻存，采用ELISA检测血清IL-1β、IL-6水平。采血后取大鼠大脑皮层组织、海马组织及肺组织，进行固定、脱水、包埋、固化处理后在电镜下观察。

1.6 统计学分析 采用Graphpad Prism 7软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，采用单因素方差分析进行组间比较，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清IL-1β和IL-6水平的比较 与正常组相比，模型组血清IL-1β水平升高(P<0.05)；与模型组相比，西药+等剂量涤痰解毒方组、等剂量涤痰解毒方组、高剂量涤痰解毒方组的血清IL-1β水平降低(均P<0.05)，但各药物干预组之间比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。6组间血清IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 6组大鼠血清IL-1β和IL-6水平的比较(x±s，pg/mL)

2.2 各组大鼠肺组织、海马、大脑皮质组织的超微结构 经治疗后，各个药物干预组大鼠的肺组织、海马CA1区和CA3区神经组织、脑皮质细胞损伤程度均较模型组有所改善。见图1、图2、图3。

图1 6组大鼠肺组织电镜下的超微结构(×18 500)

图2 6组大鼠海马组织电镜下的超微结构(×18 500)

图3 6组大鼠脑皮质组织电镜下的超微结构(×18 500)

3 讨 论

AOPP病情凶险，病死率高，全球范围内每年约有100万人发生有机磷中毒，严重危及患者的生命安全[3-5]。AOPP常用的治疗方案为阿托品与血液灌流联合治疗，及时、足量、重复给药直至达到阿托品化，该方案可在一定程度上可缓解AOPP患者的症状[6-7]，但阿托品化后患者常出现头痛眩晕、心烦失眠、多梦、胸闷纳呆、倦怠无力等后遗症。中期AOPP患者常表现为呼吸气促、喉间少痰、汗出、腹胀、烦闷不安、头晕目眩、舌苔白腻等症状，查体肺部听诊可有湿啰音，中医辨证应为痰湿内阻，根据这些证型，可以采用祛痰利湿法治疗，我科自拟涤痰解毒方治疗中期AOPP，重在宣肺祛痰，改善患者的呼吸功能。涤痰解毒方的组方为陈皮15 g、半夏10 g、茯苓20 g、胆南星10 g、竹茹10 g、川芎15 g、枳实10 g、厚朴15 g、瓜蒌15 g、党参15 g、桔梗15 g、生甘草10 g。其中陈皮、胆南星、半夏、瓜蒌清热袪痰，枳实破痰利膈，竹茹清化热痰解郁，桔梗宣肺化痰，厚朴行气化痰消腹胀，川芎补益气血、活血化瘀，人参、茯苓、甘草补心益脾、益气固表。综合全方，即祛痰宣肺，兼补气血，驱邪固本，标本兼顾，结合西医治疗，可用于AOPP阿托品化后的治疗，改善患者预后。

研究表明，当大量有机磷农药进入机体后，机体免疫系统启动应激反应，生成大量促炎症细胞因子，导致患者发生全身炎症反应综合征，进一步发展至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[8-9]。另有研究显示，AOPP激活单核巨噬细胞系统，使 IL-1β、IL-6等炎症因子水平升高，引起瀑布效应，进而引起全身炎症反应综合征，甚至脏器功能衰竭[10]。所以，早期清除AOPP患者体内的炎症细胞因子是阻止MODS发生的关键。本研究中，AOPP大鼠阿托品化后血清中炎症因子IL-1β水平升高(P<0.05)，符合有机磷农药中毒后炎症因子爆发的病理反应；西药+等剂量涤痰解毒方、等剂量涤痰解毒方、高剂量涤痰解毒方治疗均能降低AOPP阿托品化后大鼠血清炎症IL-1β水平(P<0.05)，说明涤痰解毒方单独或联合长托宁在缓解AOPP大鼠阿托品化后的炎症反应均有较好效果。虽然各药物干预组的血清IL-6水平也有所降低，但差异并无统计学意义(P>0.05)，考虑与样本量小有关。

AOPP最常见且最为严重的并发症为呼吸衰竭， 包括中枢性呼吸衰竭与周围性呼吸衰竭[11]。其中，中枢性呼吸衰竭主要是由呼吸中枢被有机磷直接或间接抑制而导致，多发生在中毒24 h以内。有机磷农药可引起严重的脑干损伤，病理表现主要为脑干水肿、出血，神经细胞凋亡、坏死，这些脑干呼吸中枢的损伤可直接引起呼吸衰竭。本研究的电镜结果显示，模型组中大鼠出现肺泡间隔水肿，肺泡间质中胶原沉积较多，肺泡腔有渗出，海马的结构破坏严重、神经细胞核严重固缩、线粒体肿胀，且脑胶质细胞肿胀，核内染色质溶解，符合AOPP后肺部和中枢神经损伤的表现。涤痰解毒汤单独或联合长托宁均可减少大鼠肺组织胶原蛋白沉积，减轻肺组织纤维化，从而达到延缓呼吸衰竭进程效果；可阻滞神经细胞核固缩，减轻线粒体肿胀及血管周围足突肿胀，防止脑干水肿、神经细胞凋亡，避免因脑干呼吸中枢损伤致呼吸衰竭。

综上所述，涤痰解毒方可通过抑制炎症因子释放、延缓肺纤维化进程、减轻脑组织损伤，促进AOPP大鼠阿托品化后机体的恢复。