猪链球菌2型HNB-LAMP检测方法的建立

席小燕，陈家享，梁嘉雯，林 蝶，伍嘉慧，段昌平，陈家苑， 彭 凌

（1.韶关学院 医学院，广东 韶关 512026；2.韶关学院 英东生物与农业学院，广东 韶关 512005）

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种重要的人畜共患病病原体，可引起猪和人的脑膜炎、败血症、肺炎等严重的临床疾病［1-2］. 猪链球菌病成了养猪业及猪肉行业中的一种职业病，在东南亚国家，普通人群面临的风险主要是由于与动物的密切接触或食用生猪肉产品［3-5］. 到目前为止，已鉴定出33个猪链球菌血清型（1~31、1/2和33）［6-8］，最常见的是从全世界猪和人的临床病例中分离出来血清型2型［9-11］.

快速准确检测猪链球菌2型对于这种感染的早期诊断和治疗非常重要，但常用的细菌培养方法分离和鉴定耗时；基于PCR的检测方法表现出对猪链球菌的高度敏感和特异，但需要昂贵的仪器、复杂的技术和烦琐的操作，不适合现场检测和基层推广［12-14］. 因此，迫切需要建立一种简便、快速、经济的检测猪链球菌2型的方法. 环介导等温扩增（LAMP）法是Notomi等人开发的一种新型的恒温核酸扩增方法［15］，不需要进行烦琐的变性、延伸、退火等温度变化的过程，只需恒温操作，无需借助PCR仪，扩增产物可以经过直接观察沉淀量或者加入染料观察颜色改变等进行检测，很适合基层使用.

笔者选择2型猪链球菌cps2J基因序列设计筛选LAMP引物组，通过体系优化建立检测方法，同时考虑到LAMP扩增产物的检测方法多样且检测的结果可能受到各种因素的影响［16］，在猪链球菌2型LAMP方法建立中比较了肉眼观察沉淀、琼脂糖凝胶电泳、SYBR Green Ⅰ以及羟基萘酚蓝（HNB）等检测方法的敏感性，建立了猪链球菌2型“量身定制”的快速LAMP检测方法.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用菌株均为实验室保存. 12株经标准血清和血清型特异PCR鉴定的猪链球菌血清型1、2、7和9型（2型9株，其它血清型各1株）. 另有5株阴性对照菌株：猪丹毒丝菌、副猪嗜血杆菌、猪鼻支原体、胸膜肺炎放线杆菌、肺炎链球菌. Taq PCR Master Mix、dNTPs、细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（B518225）、8 U Bst DNA聚合酶等均购自生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.2 引物的设计和合成

根据GenBank公布的猪链球菌2型的cps2J基因的保守序列，采用在线引物设计 软 件（https：//LAMP.neb.com）设 计LAMP引 物，另外，根据cps2J基因的保守序列设计特异的PCR检测引物，序列见表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.

表1 引物序列设计

1.3 DNA提取

过夜培养的菌液取1 mL，离心收集菌体按照“1.1”试剂盒的说明书提取各样品基因组DNA.

1.4 LAMP 反应体系条件的优化

25 μL初 始 反 应 体 系：10×Thermo-Pol buffer 2.5 μL，100 mmol·L-1的MgSO41.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 3.5 μL，40 μmol·L-1内引物（FIP/ BIP）各1 μL，5 μmol·L-1外引物（F3/B3）各1 μL（引物浓度比8∶1），20 μmol·L-1环引物（LF/LB）1 μL，8 U Bst DNA 聚合酶1 μL，3 mmol·L-1的HNB 1 μL，剩余用水补足，混匀. 65 ℃恒温反应1 h，80 ℃灭活10 min. 同时以无核酸水作为阴性对照. 在此反应体系的基础上优化LAMP反应条件，使用从猪链球菌2型菌株提取的DNA作为模板，对孵育温度（60~65 ℃）、反应时间（20~80 min）、镁离子浓度（2~10 mmol·L-1）、dNTPs 浓度（1~5 mmol·L-1）和引物浓度比（FIP/BIP∶F3/B3）等条件进行优化.

1.5 LAMP产物分析

（1）肉眼观察沉淀. LAMP反应结束后，5 000 r·min-1离心数秒后，若出现白色沉淀则被认为是阳性.

（2）琼脂糖凝胶电泳. LAMP反应结束后，产物进行2%琼脂凝胶电泳，用凝胶成像系统观察条带，如果样本显示出典型的阶梯状带型，则被认为是阳性.

（3）SYBR Green Ⅰ检测. LAMP反应后，加入1 μL SYBR Green Ⅰ，如果溶液变成绿色，则为阳性；如果溶液变成橙色，则为阴性［16］.

（4）HNB检测. HNB被预先加入LAMP系统（终浓度120 μmol·L-1），观测颜色，天蓝色为阳性，紫色为阴性［16］.

1.6 LAMP敏感性

猪链球菌2型菌株的培养菌液经计数后进行10倍梯度稀释至10-7（原始浓度为8×106CFU·μL-1），稀释菌液煮沸10 min后各取1 μL上清作为模板按优化体系和条件进行LAMP扩增，分别采用肉眼观察沉淀、琼脂糖凝胶电泳、SYBR Green Ⅰ 和HNB等对LAMP扩增产物进行检测，比较它们的检测敏感性，同时以无核酸水作为阴性对照. 为评估LAMP的敏感性，同时采用普通PCR检测上述梯度的模板（即用普通PCR检测法来进行比较），PCR反应体系25 μL：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的引物各1 μL；扩增程序：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；54 ℃，30 s；72 ℃，60 s，循环30次；最后72 ℃延伸10 min，产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测.

1.7 LAMP特异性

采用优化好的LAMP体系，对12株猪链球菌和5株阴性对照菌株的基因组DNA，进行LAMP扩增，验证该方法鉴定出猪链球2型菌株的特异性.

1.8 临床样本检测

采集猪的组织作为检测样品. 样品预处理：剪成小块后加入少量PBS缓冲液经研钵研碎，加PBS稀释，煮沸 10 min，静置或离心后，上清液可以作为检测模板.

2 结果

2.1 LAMP最优反应体系条件

在不同 条件下 进行了 实 验，最 终确 定 最优 反 应体 系 条件为：100 mmol·L-1的MgSO42.5 μL， 10 mmol·L-1dNTPs 4.0 μL，10×Thermo-Pol buffer 2.5 μL，30 μmol·L-1内引物（FIP/BIP）各1 μL， 5 μmol·L-1外引物（F3/B3）各1 μL（引物浓度比6∶1），20 μmol·L-1环引物（LF/LB）1 μL，8 U Bst DNA 聚合酶 1 μL，3 mmol·L-1的HNB 1 μL，剩余用水补足，混匀. 61 ℃恒温反应50 min，80 ℃灭活10 min.

2.2 4种LAMP扩增产物检测方法的敏感性

各稀释度模板经LAMP扩增后，各管经离心，在100~10-5稀释度可见明显沉淀，在10-6~10-7稀释度未见肉眼可以沉淀. 各稀释度LAMP扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结果显示在100~10-6稀释度均可以看到典型的梯度条带，在10-7稀释度未见条带. LAMP扩增完成后加入SYBR Green Ⅰ显色，在100~10-6稀释度显出绿色，在10-7稀释度显橙色. 在HNB检测中，预先在各稀释度检测管加入3 mmol·L-1HNB 1 μL，反应结束后在100~10-6稀释度显天蓝色，在10-7稀释度显紫色（图1 A~D）. 由此可见采用琼脂糖凝胶电泳、SYBR Green Ⅰ、HNB对产物进行检测的敏感性相当，均为8 copies/反应，而肉眼观察沉淀的敏感性为80 copies/反应. 图1 E为普通PCR检测的敏感性，仅100~10-4稀释度可见目的条带，而10-5~10-7稀释度未扩增，可见其敏感性为800 copies/反应.

图1 LAMP不同检测方法及普通PCR检测的敏感性比较

2.3 LAMP特异性

为评估LAMP的特异性，用优化的HNB-LAMP检测系统来扩增菌株提取的DNA. 所有9株猪链球菌2型菌株均呈天蓝色，而其他猪链球菌血清型菌株和阴性对照菌均呈紫色，见图2，表明实验建立的cps2J-HNB-LAMP对猪链球菌2型具有高度特异性.

图2 LAMP特异性检测

2.4 临床样品检测

对10份临床样品进行检测， 结果表明其中5份样品LAMP检测为阳性，而普通PCR检测全为阴性.

3 讨论

近年来，基于PCR技术的分子检测可用于检测猪链球菌2型，但不适合基层推广使用. 而LAMP检测有优势，已被广泛用于病原检测，笔者建立了猪链球菌2型HNB-LAMP检测方法，并比较了4种方法对LAMP扩增产物的检测敏感性.结果发现，4种方法检测敏感性均高于普通PCR检测，其中肉眼观察沉淀法敏感性最低，其它3种方法敏感性相当，但琼脂糖凝胶电泳法需借助昂贵的电泳及成像系统，不利于基层推广，同时电泳检测需开盖进行，产物会在空气中产生气溶胶，在之后的检测中产生假阳性［16］. SYBR GreenⅠ法不需要任何设备，但同样要开盖进行，容易导致检测假阳性. HNB法反应不需开盖，不会有气溶胶溢出，可以减少假阳性，且反应颜色稳定，所以最终选择HNB法对产物进行检测. 采用HNBLAMP检测敏感性可达8 copies/反应，与先前荧光定量PCR检测猪链球菌2型方法相当［14］，比普通PCR检测的敏感性高了100倍，表明该法特异性好.

把建立的HNB-LAMP检测方法应用于临床样品检测，结果表明10份临床样品，采用LAMP检测出5份阳性，而采用普通PCR检测全为阴性，说明LAMP比普通PCR检测更适合于猪链球菌感染的检测，究其原因是因为LAMP检测敏感性远高于普通PCR检测.同时考虑到临床样品检测如需使用试剂盒提取DNA后进行检测将会提高费用，并延长检测时间，实验中样品未经试剂盒提取DNA来获取较纯DNA模板，而是仅经过简单预处理后煮沸10 min取上清液作为检测模板，表明此方案可行. 该法50 min完成检测，检测结果可肉眼观察，在检测猪链球菌2型方面具有良好的临床潜力，适合基层单位使用.