液相色谱串联质谱法测定大鼠血浆中知母皂苷A-Ⅲ质量浓度及其药物代谢动力学研究*

陈宝婷，陈举亮，詹亚坤，张素方

（广东省中医院珠海医院，广东 珠海 519015）

知母具有清热泻火、生津润燥功效，临床用于高热烦渴、骨蒸潮热、虚烦不眠等症，常与黄柏以药对形式配伍应用，经典方剂有滋肾通关丸、知柏地黄丸、大补阴丸等。知母总皂苷是知母中主要的有效甾体皂苷，知母皂苷A-Ⅲ（TA-Ⅲ）又称西陵皂苷A-Ⅲ，是知母总皂苷的主要活性成分，抗癌、抗衰老、抗血管生成、抗氧化、降血糖、抗抑郁、抗血小板聚集、扩张血管、改善记忆力等作用显著［1-9］。目前，关于测定生物基质中TA-Ⅲ的方法有液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法［10］和高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）法［11］，但存在血浆用量大、离子抑制效应严重、选择性和灵敏度低、线性范围窄、运行时间长等不足。为此，本研究中建立了测定大鼠血浆中TA-Ⅲ的LC-MS/MS法，并考察其药物代谢动力学（PK）特征，为其临床合理应用提供参考。现报道如下。

1 仪器、试药与动物

1.1 仪器

API4000+型液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国Applied Biosystems公司），配有Turbo Ionspray离子源及Analyst 1.6数据处理系统；LC-20AD型高效液相色谱系统（日本Shimadzu公司），配有DGU-20A3型在线真空脱气机，LC-20AD型泵，SIL-20AC型自动进样器，CBM-20A型控制器，CTO-20A型色谱柱柱温箱；Microfuge 16型台式微量离心机（美国贝克曼库尔特公司）；Milli-Q型超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试药

TA-Ⅲ对照品（天津中新药业中药现代化技术工程中心，批号为MUST-15020108，纯度＞99%）；人参皂苷Rg2对照品（内标，中国食品药品检定研究院，批号为110406，纯度＞99%）；知母（批号为110501），黄柏（批号为120104991），均购自广州致信中药饮片有限公司；乙腈和乙酸铵均为色谱纯，水为超纯水。

1.3 动物

SPF级SD大鼠12只，雄性，体质量230～270 g，购自广东省医学实验动物中心，动物合格证号为（粤）0100527，实验动物使用许可证号为SYXK（粤）2018-0094。所有大鼠均饲养于温度为20～25℃、相对湿度为40%～70%的房间内，自然明暗循环1周。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

1）色谱条件。色谱柱：Agilent XDB-C8柱（150 mm×2.1 mm，5µm）；流动相：乙腈-2 mmol/L乙酸铵（55∶45，V/V）；流速：250µL/min；柱温：35℃；进样量：5µL。

2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源；喷雾电压：4 500 V；雾化温度：500℃；雾化气：60 psi；加热辅助气：40 psi；气帘气：20 psi；碰撞气：12 psi；检测方式：负离子多离子反应监测；用于定量分析的离子质荷比（m/z）：739.5→577.4（TA-Ⅲ），783.5→475.2（内标）。

2.2 溶液制备

取TA-Ⅲ对照品1.50 mg，精密称定，加55%乙腈配制成质量浓度为150 µg/mL的TA-Ⅲ贮备液，置4℃冰箱保存，备用。

取人参皂苷Rg2对照品10 mg，精密称定，加55%乙腈配制成质量浓度为1 mg/mL的内标贮备液，继续加55%乙腈稀释成质量浓度为20µg/mL的内标工作液，置4℃冰箱保存，备用。

分别称取知母100 g和知母-黄柏（1∶1，m/m）200 g，加适量超纯水浸泡30 min，加热回流提取3次，每次60，60，45 min，3次加入的超纯水体积比为5∶3∶3（V/V/V），趁热滤过，合并滤液，浓缩得知母单煎液、知母-黄柏（1∶1，m/m）合煎液。采用LC-MS/MS法测定各煎液中TA-Ⅲ的质量浓度，加超纯水稀释，得TA-Ⅲ质量浓度均为0.117 mg/mL的知母供试品溶液和知母-黄柏（1∶1，m/m）供试品溶液。

2.3 样品处理

吸取大鼠血浆样品50µL，加内标工作液20µL，涡旋振荡30 s，加乙腈200µL，涡旋振荡2 min，离心（转速为13 000 r/min）10 min，吸取上清液150µL，加90µL超纯水，涡旋振荡30 s，离心（转速为13 000 r/min）30 s，0.2µm薄膜滤过，取滤液，按2.1项下试验条件进样测定。

2.4 方法学考察

专属性试验：取空白血浆、空白血浆+TA-Ⅲ+内标、灌胃TA-Ⅲ血浆样品各适量，按2.3项下方法处理，按2.1项下试验条件进样测定。结果TA-Ⅲ和内标保留时间分别为3.15 min和1.55 min，色谱峰峰形良好，分离完全，无内源性物质与其他物质干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

标准曲线与定量下限确定：取2.2项下TA-Ⅲ贮备液，用55%乙腈稀释至质量浓度为60 µg/mL，精密吸取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加空白血浆配制成质量浓度为3 000 ng/mL的TA-Ⅲ标准血样。加入空白血浆，稀释得质量浓度分别为0.3，1，3，10，30，100，300，1 000，2 500，3 000 ng/mL的系列TA-Ⅲ标准血样，按2.3项下方法处理，按2.1项下试验条件进样测定。以TA-Ⅲ和内标峰面积比值为纵坐标（Y）、TA-Ⅲ质量浓度为横坐标（X，ng/mL）进行加权线性回归（权重为1/X2），得回归方程Y=4.88×10-4X+1.31×10-4（r=0.999 3，n=10）。结果表明，TA-Ⅲ质量浓度在0.3～3 000 ng/mL范围内与TA-Ⅲ和内标峰面积比值线性关系良好。定量下限为0.3 ng/mL。

1.TA-Ⅲ2.人参皂苷Rg2A.空白血浆 B.空白血浆+TA-Ⅲ+内标 C.灌胃TA-Ⅲ血浆图1专属性试验液相色谱串联质谱图1.TA-Ⅲ2.Ginsenoside Rg2A.Blank plasma B.Blank plasma+TA-Ⅲ+internal standard C.Plasma obtained from rats after the gastrointestinal administration of TA-ⅢFig.1 LC-MS/MS chromatograms of the specificity test

精密度与准确度试验：取2.2项下TA-Ⅲ贮备液，用55%乙腈稀释至质量浓度为60 µg/mL，精密吸取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加空白血浆配制成质量浓度为3 000 ng/mL的TA-Ⅲ标准血样。加入空白血浆，稀释得质量浓度为1，1 500，2 500 ng/mL的系列TA-Ⅲ质控样品，各5份，按2.3项下方法处理，按2.1项下试验条件进样测定，于同1 d和连续3 d测定质控样品中TA-Ⅲ的质量浓度。以日内和日间相对标准偏差（RSD）考察方法的精密度，以相对回收率（实测浓度与真实浓度的比值）考察准确度。结果见表1。

表1 血浆中TA-Ⅲ的精密度与准确度试验结果（%，n=5）Tab.1 Results of the precision and accuracy tests of TA-Ⅲin plasma（%，n=5）

提取回收率与基质效应试验：按精密度与准确度试验项下方法制备质量浓度为1，1 500，2 500 ng/mL的TA-Ⅲ质控样品，各5份，按2.3项下方法处理，按2.1项下试验条件进样测定，得峰面积（A1）；取空白血浆，按2.3项下方法处理，按2.1项下试验条件进样测定，得峰面积（A2）；用乙腈沉淀空白血浆，取上清液150µL，加内标工作液与TA-Ⅲ贮备液各适量，使TA-Ⅲ的质量浓度分别为1，1 500，2 500 ng/mL，按2.3项下方法处理，按2.1项下试验条件进样测定，得峰面积（A3）。按公式计算基质效应，基质效应（%）=（A3/A1×100%）；按公式计算提取回收率，提取回收率（%）=（A2/A3×100%）。结果见表2。

表2 血浆中TA-Ⅲ的提取回收率与基质效应试验结果（±s，%，n=5）Tab.2 Results of the extraction recovery and matrix effect tests of TA-Ⅲin plasma（±s，%，n=5）

表2 血浆中TA-Ⅲ的提取回收率与基质效应试验结果（±s，%，n=5）Tab.2 Results of the extraction recovery and matrix effect tests of TA-Ⅲin plasma（±s，%，n=5）

质量浓度1 ng/mL 1 500 ng/mL 2 500 ng/mL提取回收率96.03±3.94 100.66±1.68 102.11±1.31基质效应90.63±6.45 83.57±0.26 88.88±0.49

残留效应试验：按精密度与准确度试验项下方法制备质量浓度为2 500 ng/mL的TA-Ⅲ质控样品，并取空白血浆样品，按2.1项下试验条件分别交替进样分析6次，考察TA-Ⅲ与内标的残留效应。结果高浓度的TA-Ⅲ进样后几乎无残留，符合方法学要求。

稳定性试验：按精密度与准确度试验项下方法制备质量浓度分别为1，1 500，2 500 ng/mL的TA-Ⅲ质控样品，各5份，分别将样品于室温下放置4 h、反复冻融3次、4℃放置24 h后，按2.3项下方法处理，按2.1项下试验条件进样测定。结果见表3。

表3 血浆中TA-Ⅲ的稳定性试验结果（±s，%，n=5）Tab.3 Results of the stability test of TA-Ⅲin plasma（±s，%，n=5）

表3 血浆中TA-Ⅲ的稳定性试验结果（±s，%，n=5）Tab.3 Results of the stability test of TA-Ⅲin plasma（±s，%，n=5）

质量浓度1 ng/mL 1 500 ng/mL 2 500 ng/mL室温（4 h）109.25±8.99 90.17±3.82 91.30±0.82反复冻融（3次）108.00±9.06 91.83±2.52 91.20±1.90 4℃（24 h）100.24±12.31 108.80±3.69 106.80±3.88

2.5 PK研究

大鼠给药前禁食16 h，自由饮水。取12只大鼠，随机分为知母单煎液组和知母-黄柏（1∶1，m/m）合煎液组，各6只，均灌胃给药TA-Ⅲ1.17 mg/kg。分别于给药0，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，24，36 h时取眼眶血0.4 mL，置肝素化离心管中离心（转速为3 000 r/min）15 min，制备血浆，-80℃保存，待测。按2.3项下方法处理，按2.1项下试验条件进样测定TA-Ⅲ的血药浓度。采用DAS 2.1.1软件，根据非房室模型对血药浓度和时间数据进行分析，并计算PK参数（表4）。其中，药物最大浓度的时间点（tmax）和最大血药浓度（Cmax）均为实测值，采用梯形法计算血药浓度-时间曲线下面积（AUC），并绘制曲线图（图2）。结果知母单煎液组大鼠TA-Ⅲ的血药浓度低，药物吸收较慢，灌胃给药1 h后才检测到一定浓度的TA-Ⅲ。与知母单煎液组比较，知母-黄柏（1∶1，m/m）合煎液组TA-Ⅲ的血药浓度仍较低，但AUC增大，且0-∞的平均滞留时间（MRT0-∞）和消除半衰期（t1/2）均显著延长（P＜0.01）。

表4 TA-Ⅲ的PK参数（±s，n=6）Tab.4 PK parameters of TA-Ⅲ（±s，n=6）

表4 TA-Ⅲ的PK参数（±s，n=6）Tab.4 PK parameters of TA-Ⅲ（±s，n=6）

注：与知母单煎液组比较，*P＜0.01。Note：Compared with those in the Anemarrhenae Rhizoma decoction group，*P＜0.01.

PK参数AUC0-t［（µg·h）/L］AUC0-∞［（µg·h）/L］MRT0-t（h）MRT0-∞（h）t1/2（h）tmax（h）Cmax（µg/L）知母单煎液组586.90±281.50 662.59±241.35 9.23±1.88 12.92±4.05 6.99±3.00 6.33±1.97 48.65±25.07知母-黄柏（1∶1，m/m）合煎液组706.59±402.34 912.57±540.44 12.39±3.98 22.96±20.57*15.12±17.93*7.60±2.61 51.28±23.32

图2 TA-Ⅲ平均血药浓度-时间曲线（n=6）Fig.2 Mean drug concentration-time curves of TA-Ⅲ（n=6）

3 讨论

为进一步改善液相色谱的分离效能，参考文献［10-13］，在水相中分别尝试了不同比例的甲酸和乙酸铵溶液，最终确定流动相为乙腈-2 mmol/L乙酸铵（55∶45，V/V）。结果色谱峰峰形良好，TA-Ⅲ和内标保留时间分别为3.15 min和1.55 min，分析周期仅4 min。在实验样品前处理中，仅需血浆样品50 µL，是文献［12］报道血浆用量的1/2。用血量的减少有利于实验动物在连续采血的PK研究中保持良好的生理状态，更加客观地反映药物的PK特征。TA-Ⅲ的定量下限为0.3 ng/mL，比文献［10］报道的更低，保留时间也缩短，可快速、准确、灵敏地完成TA-Ⅲ的测定。

在中药复方及临床应用中，知母-黄柏药对2味药材质量比多为1∶1（m/m），如知柏地黄丸、大补阴丸等。本研究中重点考察了知母-黄柏等量配伍后，知母有效成分TA-Ⅲ的体内PK特征，并与知母单独给药进行比较。结果知母单煎液组大鼠TA-Ⅲ的血药浓度低，药物吸收较慢，灌胃给药1 h后才检测到一定浓度的TA-Ⅲ。与知母单煎液组比较，知母-黄柏（1∶1，m/m）合煎液组TA-Ⅲ的血药浓度仍较低，但AUC增大，且MRT0-∞和t1/2均显著延长。提示知母等量配伍黄柏可促进TA-Ⅲ的吸收，提高药效。

综上所述，建立的方法操作简便、结果准确可靠，可用于测定大鼠体内TA-Ⅲ的血药浓度。知母-黄柏（1∶1，m/m）合煎液促进了TA-Ⅲ的吸收，可延长其MRT0-∞和t1/2。